专利名称：具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种菌株的分离纯化方法，特别是一种具有多种活性作用的海胆共附
生菌株的分离纯化方法。
背景技术：
海胆(echinus)是一种棘皮动物，长着一个圆圆的石灰质硬壳，全身长满硬剌，形 状有心形、半球形、盘形等，壳直径一般为6 10cm，大者达30 40cm。大都生活在浅海 岩礁底或石缝中，有背光和昼伏夜出习性，主要以海藻类和小动物等为食。因海胆全身长 满可动的棘剌，故有"海剌猬"之称。海胆种类较多，据记载，全球共有850多种，主要食用 品种有紫海胆、心形海胆，主要养殖品种有紫海胆、马粪海胆。海胆的营养价值很高，其 体内的生殖腺，称为海胆卵，又称海胆黄、海胆膏。海胆卵有生殖和储存营养的作用，又是种 特殊风味的美食，是海洋食品中名贵的珍品。海胆卵不仅味美而且营养丰富，蛋白质含量 15. 8%，脂肪含量为8. 5%，糖类含量为2. 2%还有多糖、磷脂、维生素、氨基酸和矿物质等 等。 海胆不但具有较高的食用价值，同时还有极好的药用功能，尤其对心血管疾病有 较好的防治效果。中医认为，海胆黄有强精、壮阳、益心、强骨、补血的功效。海胆具有化痰 消肿，治疗白血病，抗肿瘤，雄性激素样，毒性作用等功效。而海洋动植物共附生的微生物提 高了宿主在海洋中的生存能力和适应能力，产生了抑制竞争关系生物体的生长。如抗生素、 多糖、酶等都是其中产生的。人们对从海洋环境中极其多样性的微生物中开发新的特效药 寄予极大的希望。
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单、好操作、易控制的具有多种活性作用的海胆 共附生菌株的分离纯化方法，为该菌株的发酵产物在药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和 化妆品的添加剂方面的开发利用提供方便。 本发明的具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，其特征在于取
一个海胆用无菌海水冲洗干净，研磨碎后加入无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋
白胨海水固体培养基上，用三角棒涂布均匀，在37t:下培养2天，在原培养基上挑取单个形
态各异的菌落，在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上划线培养，重复上述步骤，直到有纯菌株
出现为止并编号，移入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用。 本发明的具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，具有工艺步骤简
单、好操作、易控制的优点，本方法分离的纯菌株的发酵产物在药品、生物农药和食品保鲜、
防腐剂和化妆品的添加剂方面的开发利用提供方便。
具体实施例方式
取一个海胆用无菌海水冲洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量无菌水，静置
3沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培养基上，用三角棒涂布均匀，作三个重复。37°C 下培养2天，根据观察结果，在原培养基上挑取单个形态不一样菌落，再次在牛肉膏蛋白胨 培养基上划线培养，之后观察生长情况。重复以上步骤，直到有纯菌株出现为止并编号。移 入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用，应用生理生化方法对该活 性菌株鉴定，结果属于盐杆菌属。 滤纸片法检测抑菌活性，邻苯三酚法检测超氧阴离子自由基(02—)清除作用， Fenton法检测羟自由基(*0H)清除作用，大豆子叶法测定植物诱抗活性。结果表明该菌株 的发酵产物可以作为治疗和预防清除体内过氧化物的药物或保健食品，能与辅料混合形成 各种形式的丸剂、散剂、片剂、膏剂，粉剂、水剂，颗粒剂、胶囊等；可以作为治疗皮肤表浅创 伤的药物或应用于化妆品的添加剂，在使用时可以采取经涂抹或非喷施的给药方式，使用 可以任意选用生理盐水，稳定剂，悬浮剂或乳化剂等；可以作为诱导植物抗性的生物农药， 农药形态可以是液体也可以是粉剂；可以作为食品防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂应用于食品 领域。
具体实例如下
实例1 取一个海胆用无菌海水冲洗3次后，用剪刀剪片研磨碎后加入少量无菌水，静置 沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水培养基上，用三角棒涂布均匀，作三个重复。37°C 下培养2天，根据观察结果，在原培养基上挑取单个形态不一样菌落，再次在牛肉膏蛋白胨 培养基上划线培养，之后观察生长情况。重复以上步骤，直到菌株纯化。纯化的菌株接入
液体牛肉膏蛋白胨培养基，37t:培养一天，发酵产物用除菌滤膜过滤，冰箱保存用于检测活性。 实例2 滤纸片法检测组织提取液的抑菌活性大肠杆菌Escherichia coli(EC)、变形 杆菌Proteus vulgaris (PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (SA)、产气杆菌 Enterobacter aerogenes (EA)禾口枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis (BS)用牛肉膏蛋白胨培 养基，乳酸菌Lactobacterium delbruckii (LD)用MRS培养基。酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae(SC)用YPD培养基。以上各种菌分别接种于相应的液体培养基，振荡培养24h 作指示菌。分别用移液枪取指示菌液lOOii L于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均 匀，然后将平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取海胆共附菌 株发酵产物样品10y L滴入滤纸片中央，置于37t:培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳 性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径 大小。结果本发明的菌株发酵产物对指示菌基本都具备抑菌作用，尤其对酵母菌、枯草芽孢 杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果非常显著，因此用这种菌株发酵产物开发食 品添加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间，还可直接开发成食品保鲜防腐剂。由于 该菌株发酵产物对金黄色葡萄球菌作用明显，因此可以作为治疗皮肤表浅创伤的药物或应 用于化妆品的添加剂。
实例3 超氧阴离子自由基(02—)清除作用的测定取邻苯三酚O. lmL于试管中，加入pH 8. 2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入菌株发酵产物0. 25mL，迅速混匀。在25"反应15min。使用1cm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度&，并测定本底扣除水解液 自身的干扰。菌株发酵产物对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下清除率S(X)= Ao-(Ai-Aj)/AoX100X。式中，Ao为试剂空白的吸光度值为样液的吸光度值；A」为样液 本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(02—)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧 化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的 0H，因此常用样品对超氧 阴离子自由基(02—)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao为0. 862， 经清除率公式S(X) = Ao-(Ai-AJ')/AoX100计算超氧阴离子自由基清除率。结果菌株发 酵产物的超氧阴离子自由基清除率86. 30% 。因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化 添加剂。
实例4羟自由基('0H)清除作用的测定取9mmol/L的FeS04lmL、9mmol/L的水杨酸-乙 醇溶液lmL、菌株发酵产物lmL，最后加入8.8mmol/L的H202 lmL启动反应。在37。C反应30 分钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510nm下测各个提取液吸光度值。菌株发酵产 物对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算
SA = [ (Ac-As) / (Ac-Ao) ] X 100 % 式中，Ac为对照组0D值；As为样品组0D值；A。为空白组0D值。羟基自由基(*0H) 是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体内最活跃的活性氧自由基， 辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。羟 自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，并损伤生物膜的功 能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H202和Fe2+混合发生Fenton反 应，生成具有很高反应活性的 OH，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具 有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。 对照组0D值Ac 1. 053，空白组0D值Ao0. 018。
经公式SA = [(Ac-As)/ (Ac-Ao)]X100X算出羟自由基清除率SX，该菌株发酵产物清除羟自由基(*0H)的清除率 为80. 8%，因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂
实例5 大豆子叶法测定植物诱抗活性将发芽大豆，放入洗净的解剖盘当中浇水浸没，放 入光照培养箱培养，每天浇水培养4-5天待大豆长出两片真叶后即可进行活性测定。在无 菌条件下，将刚刚长出真叶的大豆子叶剪下，用8%次氯酸钠溶液灭菌5分钟，再用无菌水 冲洗。用刀片削去子叶外表皮厚约lmm，直径约6m的伤口 ，用无菌水浸泡清洗，约30秒后取 出，滤纸拭干后放入铺有湿滤纸培养皿中，每皿10片子叶作为一个处理。每组样液一个处 理，每个处理做一次重复，对照组用无菌水。使用微量移液器取菌株发酵液每lOii L加在一 个伤口上。处理后的子叶在2『C黑暗的温箱中培养24小时后，将每皿中的子叶转移到一个 盛有10mL双蒸水的试管中，充分振荡，用紫外分光光度计在286nm处测定0D值。结果菌株 发酵产物处理的样品OD值明显高于阳性对照(壳寡糖)，因此植物诱抗活性显著，可应用于
生物农药的开发。
实例6 采用生理生化方法鉴定活性菌株，结果表明该活性菌株为革兰氏阴性，细菌为杆 状，有荚膜，无芽孢，菌落呈圆形、略扁平，属于兼性好养微生物，产生过氧化氢酶，能还原硝
5酸盐，不能产生H2S，不能分解淀粉，在pH值为5-9长势最好，属于盐杆菌属。
上述实施例说明，本发明具有如下优点 效果显著。本发明纯化的菌株发酵产物物具有抗氧化、抑菌和植物诱抗等多种显 著生物活性。 原料来源丰富，价格低廉，制备方法简便。菌株发酵采用最常用的牛肉膏蛋白胨培 养基，所用的试剂均为常见试剂，价格便宜，发酵反应条件容易操作，可适合大规模生产。
发展前景广阔，意义深远。本发明通过实验研究海胆共附菌株发酵产物的抗氧化 活性、抑菌活性和植物诱抗活性，为新的治疗和防治与抗氧化相关疾病的药物的研究与开 发提供一定的理论依据，为研究开发新的食品或化妆品保鲜防腐剂提供依据；也为开发新 的生物农药提供新思路。
权利要求
一种具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，其特征在于取一个海胆用无菌海水冲洗干净，研磨碎后加入无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上，用三角棒涂布均匀，在37℃下培养2天，在原培养基上挑取单个形态各异的菌落，在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上划线培养，重复上述步骤，直到有纯菌株出现为止并编号，移入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用。
全文摘要
一种具有多种活性作用的海胆共附生菌株的分离纯化方法，取一个海胆用无菌海水冲洗干净，研磨碎后加入无菌水，静置沉淀，取上清液滴加在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上，用三角棒涂布均匀，在37℃下培养2天，在原培养基上挑取单个形态各异的菌落，在牛肉膏蛋白胨海水固体培养基上划线培养，重复上述步骤，直到有纯菌株出现为止并编号，移入斜面和液体牛肉膏蛋白胨培养基中培养1天，冰箱保存备用。具有工艺步骤简单、好操作、易控制的优点，本方法分离的纯菌株的发酵产物在药品、生物农药和食品保鲜、防腐剂和化妆品的添加剂方面的开发利用提供方便。
文档编号A61P31/04GK101735970SQ20091024896
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月29日 优先权日2009年12月29日
发明者张付云 申请人:大连水产学院