专利名称：：具有多种生物活性的螠蛏酶解液的制备方法
技术领域：
：本发明发明涉及一种酶解液的制备方法，特别是一种具有多种生物活性的螆蛏酶解液的制备方法，该酶解液可作为治疗和预防肿瘤和疲劳疾病、滋润营养毛发、促进生长和清除体内过氧化物的药物、保健食品、食品的添加剂或作为洗发护发用品原料。
背景技术：
：鎰蛏(SinonovaculaconstrictaIamarck)俗名蛏子、青子、竹蚶、海蛏，隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲(LameUibranchia)、真瓣鳃目(Eulamellibranchia)、蛏科(Pharellidae)，是中国和日本特有的种类，也是中国沿海养殖的重要贝类之一。螆蛏肉味鲜美，营养丰富，蛋白质含量5.5%，脂肪0.8%，糖1.8%和无机盐1.1%。螆蛏的软体部还有补虚的作用，对阴虚、血虚效果最佳，产后、病后多用之。近年来，海洋贝类的研究已引起人们极大重视，海洋贝类中具有多种生物活性肽、多糖、不饱和脂肪酸，是研制海洋保健食品和功能食品的重要原材料，如Bordenave等将太平洋牡蛎(Crassostreagigas)用胃蛋白酶水解得到具有抑制ACE能力的水解产物；文蛤(Meretrixmeretrix(Linnaeus))多糖对不同剂量的环磷酰胺(CTX)引起的迟发型超敏反应(DTH)有双向调节功能等。但是目前关于螆蛏的研究多集中在干制品加工及营养成分分析方面，对其生物活性的研究甚少，产品品种单调，价格偏低，在一定程度上限制了螆蛏养殖业的发展和螆蛏肉用组织的利用。
发明内容本发明的目的是提供一种工艺步骤简单、好操作、易控制、加工成本低的具有多种生物活性的螆蛏酶解液的制备方法，为治疗和预防肿瘤和疲劳疾病、滋润营养毛发、促进生长和清除体内过氧化物的药物、保健食品、食品提供一种良好的添加剂，为洗发护发用品提供了一种好的原料。本发明的具有多种生物活性的螆蛏酶解液的制备方法，由如下步骤组成a、将新鲜的螆蛏肉用组织捣碎用匀浆机制成肉糜；b、将肉糜装瓶加水，并加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，调节pH值达6，水解6小时，温度为6(TC;肉糜与水的用量比为每30g肉糜加入50mL水；c、用加温方式做灭酶处理，温度为85°C，时间为10分钟；d、对上步形成的液体以4500转/分的速度进行离心处理，时间控制在20分钟，然后取上清液即为酶解液。本发明的具有多种生物活性的螆蛏酶解液的制备方法，工艺步骤简单，操作容易，好控制，加工成本低；为治疗和预防肿瘤和疲劳疾病、滋润营养毛发、促进生长和清除体内过氧化物的药物、保健食品、食品提供一种良好的添加剂，为洗发护发用品提供了一种好的原料。具体实施例方式本发明的方法由如下步骤组成a、将新鲜的螆蛏肉用组织捣碎匀浆机制成肉糜；b、将肉糜装瓶加水，并加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，调节pH值达6，水解6小时，温度为6(TC;肉糜与水的用量比为每30g肉糜加入50mL水；c、用加温方式做灭酶处理，温度为85°C，时间为10分钟；d、对上步形成的液体以4500转/分的速度进行离心处理，时间控制在20分钟，然后取上清液即为酶解液。本发明的方法制备的酶解液可做治疗和预防肿瘤和疲劳疾病、滋润营养毛发、促进生长和清除体内过氧化物的药物、保健食品、食品的添加剂，也可做为洗发护发用品的原料。将螆蛏肉用组织捣碎匀浆机制成肉糜并称取30g，装入三角瓶，加入50mL水，加入肉糜的0.3%的木瓜蛋白酶，调节pH值达6，恒温水解(60°C)，高温灭酶(85°C，10分钟)，酶解液以4500转/分离心20分钟，取上清液即为酶解液，定容至60mL用于测定活性。温度、酶量、pH值和时间是直接影响螆蛏肉水解效果的重要因素，故将其作为本试验的正交因素，并选取3个水平设计L9(34)正交试验，并用抑菌活性和抗氧化活性来考察各组实验水解效果。对抑菌活性和抗氧化活性均好的酶解液进行促生长、秀毛发、抗疲劳和抑制肿瘤细胞生长活性检测，结果表明pH6，60°C，酶加入量为底物的0.3%，水解6h的螆蛏组织酶解液可以制备成各种形式的丸齐U、散剂、片齐U、膏剂，粉齐U、水剂，颗粒齐U、胶囊等药物；制备成保健食品可以是液体的比如像清凉饮料，口服液，乳酸饮料，调味品；作为食品添加剂，比如加入到面食类，果冻，冰淇淋，腌制品，火腿，点心中；作为滋润营养毛发的洗发护发用品，可与辅料混合形成各种形式的洗发膏、洗发水、护发素等实例1:按上述步骤将螆蛏肉用组织捣碎用匀浆机制成肉糜并称取30g，装入三角瓶，加入50mL水，加入木瓜蛋白酶，调节pH值，恒温水解，高温灭酶(85°C10min)，酶解液以4500r/min离心20min，取上清液即为水解液，定容至60mL用于测定活性。由于温度、酶量、pH值和时间是直接影响螆蛏组织水解效果的重要因素，故将其作为本试验的正交因素，并选取3个水平设计L9(34)正交试验，得到9组酶解液。表l酶解正交实验因素水平<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>滤纸片法检测组织提取液的抑菌活性大肠杆菌Escherichiacoli(EC)、变形杆菌Proteusvulgaris(PV)、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(SA)、产气杆菌Enterobacteraerogenes(EA)禾口枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis(BS)用牛肉膏蛋白胨培养基，乳酸菌Lactobacteriumdelbruckii(LD)用MRS培养基。酿酒酵母菌Saccharomycescerevisiae(SC)用YPD培养基。以上各种菌分别接种于相应的液体培养基，振荡培养24h作指示菌。分别用移液枪取指示菌液lOOyL于相应的固体培养基，用无菌三角涂棒涂抹均匀，然后将平板分成六个区，每个区分别放入一张滤纸片，再分别用移液枪移取酶解样品10L滴入滤纸片中央，置于37t:培养箱中培养。每个处理做3次重复，阳性对照为75%酒精，阴性对照为无菌水。三天后观察指示菌的生长情况，测定抑菌圈的直径大小。结果9组酶解液对酿酒酵母菌和变形杆菌均有抑制作用，但是对乳酸菌没有作用，而乳酸菌对人体是有益菌，因此这些螆蛏酶解液至少在体外不会减少乳酸菌的数量和作用；另外除了个别实验组外多数酶解产物对大肠杆菌、产气杆菌和枯草芽孢杆菌都具有一定的抑制作用，尤其③号、④号和⑧号实验组酶解液对除乳酸菌以外的菌株都有一定的抑制作用，③号组对各菌株抑制活性较强于④号组和⑧号组，④号组对酿酒酵母菌的抑菌性最强但是对其他菌株效果一般，因此就抑菌活性而言③号组最具有进一步研究的意义。金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠杆菌和产气杆菌分别属于革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，而螆蛏组织酶解液对它们均有抑制作用，因此用螆蛏组织酶解液开发功能性食品或食品添加剂可因其抑菌活性而延长产品的保藏时间。实例3:超氧阴离子自由基(02—)清除作用的测定取邻苯三酚O.lmL于试管中，加入pH8.2的Tris-HCl缓冲溶液5mL，加入不同条件下水解得到的酶解液0.25mL，迅速混匀。在25t:反应15min。使用lcm比色皿，以蒸馏水做空白对照，在320nm处时测吸光度A"并测定本底扣除水解液自身的干扰。酶解液对超氧阴离子自由基清除率的计算公式如下清除率S(%)=Ao-(Ai-Aj)/AoX100X。式中，Ao为试剂空白的吸光度值为样液的吸光度值；Aj为样液本底的吸光度值。虽然超氧阴离子自由基(02—)不能直接诱导生物和食品体系中的脂类氧化，但它会在金属离子催化下发生Fenton反应产生有高活性的0H，因此常用样品对超氧阴离子自由基(02—)的清除能力来反映其抗氧化活性。试剂空白时的吸光度值Ao为0.862，经清除率公式S(X)=Ao-(Ai-Aj)/AoX100计算超氧阴离子自由基清除率。结果螆蛏酶解液的超氧阴离子自由基清除率最高为③号实验组(提取条件pH6，6(TC，酶添加量0.3%，时间610，清除率为71.69%。因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂。实例4:羟自由基('0H)清除作用的测定取9mmol/L的FeS04lmL、9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液lmL、样品酶解液lmL，最后加入8.8mmol/L的H202lmL启动反应。在37。C反应30分钟。以水为参比，用可见光分光光度计在510nm下测各个提取液吸光度值。酶解物对羟自由基的清除效果用清除率表示，按下式计算SA=[(Ac-As)/(Ac-Ao)]X100%式中，Ac为对照组0D值；As为样品组0D值；A。为空白组0D值。羟基自由基(*0H)是一种能够激发油脂过氧化反应的较强的氧化剂，被认为是体5内最活跃的活性氧自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。羟自由基可介导许多病理变化，如引发不饱和脂肪酸的脂质过氧化反应，并损伤生物膜的功能和结构，因此羟自由基的清除对于生物体具有重要意义。H202和Fe2+混合发生Fenton反应，生成具有很高反应活性的*0H，能被水杨酸有效的捕捉，并生成有色物质；但若加入具有清除作用的物质，便会与水杨酸竞争，从而使有色产物生成量减少。对照组0D值Ac为1.243，空白组0D值Ao为0.031。经公式SA=[(Ac-As)/(Ac-Ao)]X100X算出羟自由基清除率SX，结果酶解③号组(提取条件pH6，6(TC，酶添加量O.3%，时间6h)清除率最高，为69.72%，因此可用作抗氧化药物的制备或食品抗氧化添加剂实例5:提取液对小鼠的促生长秀毛发实验小鼠40只，雌雄各半分成对照组，高剂量处理组，中剂量处理组，低剂量处理组4组，每组10只。高剂量组为縊蛏的③号木瓜蛋白酶水解液原液(0.036g/mL)、中剂量处理组为1/2原液浓度、低剂量组为1/4原液浓度。每天分别给每只小鼠以每组相对应浓度的提取液灌胃0.3mL，对照组用凉开水代替，观察20d，每天观察记录生长情况，每7天秤一次体重。其中样品处理组与对照组相比毛色光亮，体重增加明显高于对照组，且对外界剌激反应灵敏，其中以低剂量组尤为明显1.4g/7d，而对照组0.2g/7d。因此可用作营养液或洗发护发产品的开发。实例6:螆蛏组织酶解液的抗疲劳活性检测小鼠40只，灌胃20d存活的小鼠(灌胃处理同实施例5)，末次灌胃30min后，鼠身体负荷5%体重的铁丝，置小鼠在游泳箱中游泳(水深30cm)，水温25+1°C，在实验过程中需使每只小鼠的四肢保持运动，如果小鼠漂浮在水面四肢不动，可用木棒在其附近搅动。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠负重游泳时间。小鼠用不同浓度提取液灌胃20d后，进行负重游泳试验，结果剂量组负重游泳时间比对照组延长。与对照组相比(211.0+8.9)，高剂量组负重游泳时间稍有延长(252.6+7.5)，中剂量组组负重游泳时间延长并比高剂量组显著(271.7+5.0)，说明，酶解液的处理能够在一定程度上提高小鼠的抗疲劳能力。可用作抗疲劳药物或保健品的开发。实例7:将小鼠腹水型肿癌株HcaF16A复苏，在小鼠腹腔内传代，57d传代1次。传代3次后，抽取腹水.生理盐水洗涤离心(800r/minX5min)3次，调整细胞浓度至5.OX106个/mL.台盼蓝拒染法检测存活率>95%，备用。整个操作在无菌条件下进行。用无菌注射器抽取腹水瘤细胞悬液注射至昆明小鼠右前腋皮下，每鼠0.2mL，接种瘤株H后将小鼠随机分组并称重。每组IO只，雌雄各半，分别为空白组.模型组，阳性对照组，螆蛏组织酶解物高、中、低剂量(320mg/kg、160mg/kg、80mg/kg)组，每日给小鼠灌胃给药1次，每次0.2ml/20g体重；空白组和模型组灌胃等量蒸馏水；阳性对照组按剂量20mg/(kg.d)腹腔注射给药氟尿嘧啶每日1次。各组均连续给药10d，第lld时称重并脱颈椎处死小鼠，剥取瘤块，摘取脾脏和胸腺，称重，并计算抑瘤率、胸腺指数和脾脏指数。抑瘤率(％)=(模型组平均肿瘤重量-给药组平均肿瘤重)/模型组平均肿瘤重X100%:胸腺(脾脏)指数(mg/10g)=胸腺(脾脏)重量/小鼠体重。数据以(x士s)表示.采用SPSSIO.O软件中的单因素方差分析进行处理。结果表明.螆蛏组织酶解物具有很好的抑制小鼠移植性肿瘤HcaF16A活性的作用.其中以中剂量组活性最好抑瘤率达61.2%，因此可开发为新的抗癌药物。权利要求一种具有多种生物活性的螠蛏酶解液的制备方法，其特征在于由如下步骤组成a、将新鲜的螠蛏肉用组织捣碎用匀浆机制成肉糜；b、将肉糜装瓶加水，并加入肉糜的0.3％的木瓜蛋白酶，调节pH值达6，水解6小时，温度为60℃；肉糜与水的用量比为每30g肉糜加入50mL水；c、用加温方式做灭酶处理，温度为85℃，时间为10分钟；d、对上步形成的液体以4500转/分的速度进行离心处理，时间控制在20分钟，然后取上清液即为酶解液。全文摘要一种具有多种生物活性的螠蛏酶解液的制备方法，其特征在于由如下步骤组成将新鲜的螠蛏肉用组织捣碎匀浆机制成肉糜；将肉糜装瓶加水，并加入肉糜的0.3％的木瓜蛋白酶，调节pH值达6，水解6小时，温度为60℃；肉糜与水的用量比为每30g肉糜加入50ml水；用加温方式做灭酶处理，温度为85℃，时间为10分钟；对上步形成的液体以4500转/分的速度进行离心处理，时间控制在20分钟，然后取上清液即为酶解液。工艺步骤简单，操作容易，好控制，加工成本低；为治疗和预防肿瘤和疲劳疾病、滋润营养毛发、促进生长和清除体内过氧化物的药物、保健食品、食品提供一种良好的添加剂，为洗发护发用品提供了一种好的原料。文档编号A61P43/00GK101744837SQ20091024896公开日2010年6月23日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者张付云申请人:大连水产学院