：本发明属于海洋农业中贝类遗传繁育技术领域，具体涉及一种采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法。
背景技术：
：牡蛎属于软体动物门，双壳纲，珍珠贝目，牡蛎科，是一种重要的海洋生物资源，其肉味鲜美、富含多种人体必需氨基酸。为世界最重要的海水养殖经济种类之一，其养殖的总产量和单位面积产量在所有的贝类养殖品种中位居首位(张跃环，2012)。我国是牡蛎养殖大国，2010-2012年产量在350-380万吨之间；它占养殖贝类产量的35％，海水养殖总产量的25％，世界产量的70％以上(中国渔业年鉴2013)。在我国，牡蛎科至少包括5个属，分别为巨蛎属(Crassostrea)、牡蛎属(Ostrea)、小蛎属(Saccostrea)、齿蛎属(Dendostrea)、舌骨牡蛎属(Parahyotissa)等(夏建军，2008)。其中，有趣的是，牡蛎属种类繁殖方式均为幼生型，而其它属种类均为卵生型。卵生型(Oviparoustype)是指动物的受精卵在母体外独立发育，胚胎发育过程完全依靠卵细胞自身卵黄营养，可分为直接产卵排精及交配后产卵两种形式，绝大多数的贝类均属于这种繁殖方式。幼生型(Larvaetype)牡蛎在繁殖时，精卵在鳃腔中受精，发育至面盘幼虫离开母体，经过浮游阶段，附着变态。它包括牡蛎属中的密鳞牡蛎(O.denselamellosa)、欧洲牡蛎(O.edulis)、希腊牡蛎(O.lurida)等(王如才等，2008)。那么，能否改变幼生型牡蛎繁殖方式，利用卵生型手段进行幼生型牡蛎的人工繁育，成为本发明的创新点。
技术实现要素：
：本发明的目的是提供一种采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法，其可以改变幼生型牡蛎繁殖方式，提高其种群资源数量，大规模生产其苗种。本发明的采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、亲本采集：在自然海区采集野生的牡蛎属幼生型牡蛎作为繁殖群体，该类牡蛎长相比较独特，右壳壳顶部较光滑鳞片愈合，其它鳞片密薄而脆，紧密地以覆瓦状排列，为了确保该亲本准确性，最好进一步采用分子手段进行物种鉴定；b、性腺促熟：以自然条件下性腺发育较好的步骤a的繁殖群体或者促熟的步骤a的繁殖群体作为亲本，自然条件下性腺发育较好的牡蛎群体可以减少促熟时间，促熟方式可以采用室内促熟，也可以采用室外生态促熟。无论是哪一种促熟方式，均要保证饵料充足、水质清新、环境条件适宜。c、精卵分离：待亲本性腺成熟，分离精卵，之后进行受精，获得受精卵；性腺成熟的标志：少数亲本个体鳃腔中有受精卵或者正在发育的胚胎。由于大部分幼生型牡蛎属于雌雄同体，所以在获得单体精卵时要格外小心。卵子收集方法：将成熟性腺解剖在盐度3-5ppt水中，浸泡2-5min，将其精子杀死；之后经过200目筛绢网过滤，去除大的组织块，400目筛绢网浓缩，去除小的碎组织块及死亡精子；最后，滤液放置于盐度为27-30ppt海水中进行30-60min浸泡激活卵子，激活成功的标准是卵变圆，生发泡消失。精子收集方法，在卵子激活成功后，通过镜检选择精子活力好的个体性腺，经过400目筛绢网过滤，去除卵子及大的组织块，滤液即为精子，该方法可以有效的收集纯度较高的精子；之后在海水激活5-15min，选取精子活性比例高的个体作为父本。受精前，检查卵子是否被精子污染，弃掉被污染个体卵液，使用尚未受精且激活好的卵子。最后，将精子倒入卵液中受精，每个卵子周围有3-5个精子比较合适；d、子代培育：采用充气方式孵化受精卵，孵化密度控制在≤50个/mL，受精卵在温度28.2-29.4℃，盐度27-30ppt条件下，经过36h左右到达D形幼虫。对D形幼虫采用260目筛绢网选优(D形幼虫不能滤过260目筛绢网)，之后按照常规方法培养子代，即可获得大量该类牡蛎苗种。步骤a所述的幼生型牡蛎指的是牡蛎属中的密鳞牡蛎、希腊牡蛎、欧洲牡蛎等，它们繁殖时精卵在鳃腔中受精，待受精卵发育至D形幼虫阶段排出体外，经过浮游阶段之后附着变态。目前，有关于牡蛎属牡蛎繁育的研究，仅限于李琪等(2009)公开了对比文件1，即密鳞牡蛎的人工繁育方法(授权公告号：CN101731168B)；陈璐等(2011)发表了密鳞牡蛎的人工繁育(对比文件2)。对比文件1为国家发明专利，而对比文件2期刊论文，两者内容几乎完全一致。2个对比文件与本发明不同，他们均是利用密鳞牡蛎幼生型特性，待其自然排放幼体之后，进行子代培育；而本发明则是在幼生型牡蛎性腺成熟时，采用卵生型剖取精卵方式对其进行繁育，成功获得大量存活子代。本发明与2个对比文件相比，改变了传统上认为幼生型牡蛎只能待亲本排放D形幼虫后，进行子代培育的繁殖规律。本发明具有操作性强，易于推广，可用于大规模生产幼生型牡蛎苗种，进行资源恢复维持其生物多样性；同时为开展幼生型牡蛎的常规育种及多倍体育种等提供了实践基础。本发明打破了传统上认为幼生型牡蛎无法通过解剖方式进行子代繁育的观念，首次通过卵生型牡蛎繁育模式培养出幼生型牡蛎苗种，为其大规模繁殖提供了技术保证，为该类牡蛎的常规数量遗传育种及染色体操纵育种等提供了可能，也为该类牡蛎资源恢复奠定了理论与实践基础。具体实施方式：以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1a、亲本采集：于2013年6月中旬，在湛江硇洲岛采集野生密鳞牡蛎作为繁殖群体，虽然密鳞牡蛎长相比较特别，在右壳上有很多鳞片状结构。但是，有个别巨蛎属中的葡萄牙牡蛎、熊本牡蛎在其自然环境下，也会长出一些鳞片状结构。为此，采用分子手段对牡蛎的COI序列进行扩增测序，通过Blast与序列号为YP004300304的密鳞牡蛎进行比对鉴定，剔除了混淆个体，获得壳高在12-18cm密鳞牡蛎125只。b、性腺促熟：采集到的密鳞牡蛎性腺比较饱满，将其移至恒兴南方海洋生物科技有限公司1个12m3水泥池内，采用微充气方式进行促熟。每天投喂角毛藻、海链藻、酵母粉，投喂量因设施情况而定，保证饵料充足；每天换水15-30％。促熟期间，水温27.0-28.2℃，盐度27-30ppt。c、精卵分离：经过15天促熟，发现个别亲本的鳃腔中有受精卵，说明性腺已经成熟。由于该亲本大多数是雌雄同体，为此，解剖性腺进行精卵分离。卵子收集方法：将成熟性腺解剖在盐度3ppt水中，浸泡5min，将其精子杀死；之后经过200目筛绢网过滤，去除大的组织块，400目筛绢网浓缩，滤掉碎组织块及死亡精子；最后，滤液(含卵子)放置于盐度为30ppt海水中进行45min浸泡激活卵子，激活成功的标准是卵变圆，生发泡消失，此时的卵径为80-90μm。精子收集方法，在卵子激活成功后，通过镜检以精子活力好的个体性腺作为父本，再解剖性腺即可，经过400目筛绢网过滤，滤液即为精子；之后利用海水激活6min，选取精子活性比例高的个体作为父本。受精前，检查卵子是否被精子污染，弃掉被污染个体卵液，使用尚未受精且激活好的卵子。经过显微镜观察，选取30个未受精较好的卵液作为母本卵源，之后将其混合在一起，放置于60L白桶中；选取5个精子活性好的个体作为父本精源，每个精源放置于100mL烧杯中。将卵源分成5份，每份12L，利用每个精子分别与每份卵源交配，以平衡精子受精能力，维持物种结构多样性，防止近交衰退。精子使用标准，每个卵子周围有3-5个较适宜，获得受精卵。受精60min后，利用300目筛绢网洗卵，之后将其倒入12m3水泥池中孵化。d、子代培育：采用微充气方式孵化受精卵，孵化密度为12个/mL，受精卵在温度28.6-29.4℃，盐度28ppt条件下，经过36h左右到达D形幼虫，D形幼虫壳高在110-120μm。对D形幼虫采用260目筛绢网选优，收集筛绢网中的D形幼虫，之后按照常规密鳞牡蛎培育方法培养子代，约经过20d浮游期，7d变态期，24d的稚贝培育，利用1个12m3水泥池培育出240万个壳高在4-9mm的密鳞牡蛎稚贝，单位水体出苗量为20万/m3。