一种禾本科植物离体培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种禾本科植物离体培养方法，该方法是实现禾本科植物从拔节、抽穗、扬花、灌浆、乳熟、腊熟至完熟整个过程的长期离体培养的新方法，利用配置含有禾本科植物生长发育所必须的常量元素、微量元素和有机物的培养液，通过室内培养，实现禾本科植物在离体状态下正常生长发育，以保证植物生长发育过程中外界条件的一致性，剔除待研究因素外的其他因素对植株生长发育的影响，提高试验研究的精准性。该方法主要解决在研究田间栽培下禾本科植物成熟过程中生理生化指标的变化及其对某营养元素的响应时极易受到田间众多的外界环境因素的影响的问题。本发明可用于小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻和玉米等所有禾本科植物的长期离体培养，从而加速对高产、高效、优质禾本科农作物的选育。
【专利说明】一种禾本科植物罔体培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种禾本科植物离体培养的方法。
【背景技术】
[0002]传统的植物生长发育研究主要是在田间进行，影响因子非常复杂。施入田间的营养元素因土壤质地的不同和土壤微生物的作用，植株对养分的吸收和利用效率也明显受到影响。因此大田种植或盆栽培养下由于众多因素的影响，无法控制禾本科植株营养器官同化物向穗的流动，即库(穗)_源(营养元素)关系无法得到有效控制，营养元素对植物生长发育的研究往往无法精确。因而，采用离体培养技术则可以有效简化源-库关系，使得在新的源”(培养基库(穗)系统中，“源”可以得到有效的控制。这对于研究营养、激素物质和环境因子对禾本科植物生长发育的影响具有重要价值。
[0003]离体培养作为一种实验方法很早就已被采用。Buttrose和May (1959)在试验中将离体麦穗于C 一蔗糖溶液中饲喂5小时，然后转移到蒸馏水中放置9天。Drennan和Krishnamurthy (1964)于抽穗后16天剪下麦穗在灭菌条件下短期培养，研究了粒重的变化。Jenner(1968)报道将离体麦穗在蔗糖溶液中短期培养增加了籽粒淀粉含量。戴云岭等人(1968)曾将孕穗期的主茎从旗叶环以下20cm处截断，插于Knop氏溶液中饲喂30分钟，此后在不同条件(遮光和照光)下静置24小时，研究了不同处理离体器官的同化效率和同化物分配。
[0004]然而，上述试验采用离体培养方法均是短期处理。Donovan和Lee (1977)成功地建立了麦穗长期培养方法，在此方法中，将扬花后8天左右的离体麦穗在穗下约14cm处剪断，放于液体培养基中培养15天，籽粒正常生长。培养液含有蔗糖、各种氨基酸和必要的矿质元素，培养期间需将培养瓶维持在+ 1°C的冷水浴中，这对于普通实验室来说，操作条件存在很大的难度。这一方法后经Singh和Jenner (1983)改进，可使离体培养在常温下实现，但是培养时间仍然比较短(12-15天)，无法使小麦孕穗期到完熟期的整个过程得到精准研究。本发明在前人的研究基础上，经过改进，建立了一种可用于研究从拔节期、孕穗期、扬花期、灌浆期、乳熟期、腊熟期至完熟期的整个生长发育过程中植物对营养元素的吸收、利用的离体培养方法。该方法降低了培养难度，培养条件和方法简便，在日光灯光源和室温下即可实现；简化了培养基成分，不需要氨基酸，只需必要的常量元素和微量元素及简单的有机物；大大延长了培养时间，植物在还拔节或未开始扬花的孕穗期就可以实现离体培养，室内培养时间可长达60天以上，且培养方法可适用于包括小麦、黑麦、大麦、燕麦、水稻和玉米等所有禾本科植物，从而实现了植物在整个生长发育过程中对营养元素的吸收、利用的精准研究。对于实现禾本科农作物的“高产、高效、优质”发展，促进粮食生产，保证粮食安全和国家安全均具有一定的价值和意义。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于，提供一种禾本科植物离体培养方法，该方法根据离体植物在适当的环境下仍能生长发育的自我生理调节机制，利用特制培养液，实现禾本科植物从拔节或抽穗、扬花、灌浆、乳孰、腊熟和完熟的整个过程的离体培养，从而为实现禾本科植物营养吸收研究提供精准控制条件，避免田间培养时众多环境因素影响造成的研究难度和低精准度。该方法培养条件简单、方法简便，在日光灯光源和室温下即可实现；简化了培养基成分，不需要氨基酸，只需必要的常量元素和微量元素及简单的有机物；大大延长了培养时间，室内培养时间可长达60天以上,且培养方法不仅适合小麦、而且适合大麦、黑麦、燕麦、水稻和玉米等禾本科植物，提高了植物在整个生长发育过程中对营养元素的吸收、利用的研究精准度。
[0007]本发明所述的一种禾本科植物离体培养方法，按下列步骤进行:
a、按常规方法配制含有常量元素N、P、K、Ca、Mg,微量元素Fe、Μη、B、Mo、Cu、Co、Na和有机物蔗糖、烟酸、肌醇、维生素B6和维生素的培养液；
b、将配制好的培养液置于配有棉塞的广口瓶中，经1.5KPa高压灭菌120min，在温度4°C下保存；
c、于拔节期或孕穗期选择性状一致的主植株为旗叶和倒二叶的叶距为8-lOcm的主穗，用剪刀从基部剪去，置于净水中带回室内；
d、去掉下部各叶，保留旗叶和各叶叶鞘，用0.l%HgCl消毒15min，并经三次无菌水冲洗后，通过棉塞插入装有步骤b经过高压的液体培养基的广口瓶中，每5穗一瓶，室内培养，光源为日光灯，光照10小时/天，培养温度为20 - 25°C ；
e、培养过程中，密切关注植株对培养液的吸收,待植株对培养液的吸收量超过所加液体的70%，立即添加培养液，为防止培养基污染，每7-10天更换一次培养液。
[0008]步骤a培养液各组分的浓度含量为:常量元素中7.8 mmol/L NH4N03、1.66mmolLK2S04、2.5mmol/L ΚΗ2Ρ04、0.2mmol/L CaS04.2H20 和 0.3mmol/L MgS04.7H20 ;微量元素中27.8mg/L FeS04.7Η20、37.3 mg/L Na.C10H16N208.2H20、16.9 mg/L MnS04.H20、6.2 mg/L H3B03、0.83 mg/L K1、0.25 mg/L Na2M04.2H20、0.25 mg/L CuS04.5H20 和 0.025 mg/LCoCl.6H20 ;有机物为 4% 蔗糖、lOOmg/L 肌醇、1 mg/L 烟酸、1 mg/L VB6 和 1 mg/L VB10
[0009]该方法适用于小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米和水稻等从拔节或抽穗至完熟整个过程的禾本科植物离体培养。
[0010]本发明所述的一种禾本科植物离体培养方法，该方法用特制培养液作为植物正常生长发育的营养元素来源，在配置特制培养基的同时，可以根据试验研究的需要，在特制培养液中改变含有某一元素的试剂含量，以达到保证其他元素含量一致的情况下，精确研究变量营养元素对植株生长发育的影响，在改变元素含量时最好按照一定梯度来设计，避免元素浓度变化过剧影响研究目的。
[0011]本发明所述的一种禾本科植物离体培养方法，其特点为:
(1)本发明采用特制培养液对禾本科植物进行离体培养，通过严格控制培养液的组成成份和保证外界条件一致情况下，来研究禾本科植物成熟过程中的生理生化指标变化或对某元素的响应。与田间培养技术相比，本发明可以有效避免田间培养下因外界环境因素不一致所造成的误差，从而为研究植物生长发育过程对营养元素改变的生理生化指标变化提闻精度。
[0012](2)与现有的小麦离体培养技术相比，本发明可以显著延长植株离体培养的时间，实现对植株从拔节或抽穗到晚熟的整个生长发育过程的室内培养和观察，且适用于小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻和玉米等所有禾本科植物。
【具体实施方式】
实施例
[0013]培养液配制:
按常规方法配制常量元素:按浓度1.66mmol L K2S04、2.5mmol/L KH2P04、0.2mmol/LCaS04.2H20和0.3mmol/L MgS04.7H20计算各化学试剂每升所需质量，将其先后溶于1/2L重蒸馏水中，为了使试剂充分溶解，可以先溶解完全一种试剂后再溶解另一种试剂，备用；按常规方法配制不同浓度含量的氮素营养液:取5份配好的常量元素营养液，分别按0mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20 mmol/L 浓度梯度添加溶解 ΝΗ4Ν03，备用；
按常规方法配制微量元素:按浓度16.9 mg/L MnS04.Η20、6.2 mg/L Η3Β03、0.83 mg/LΚΙ、0.25 mg/L Na2M04.2Η20、0.25 mg/L CuS04.5Η20 和 0.025 mg/L CoCl.6Η20 计算每升所需质量，将其先后加入溶有常量元素的溶液中溶解，待完全溶解后备用；由于微量元素中的FeS04.7H20和Na.C10H16N208.2H20两种试剂容易产生沉淀，需单独配置这两种试剂，取待配制溶液的1/50的重蒸水，加热至沸腾，稍冷却后，按浓度27.8mg/L FeS04.7Η20计算每升所需质量，将其溶于沸腾后重蒸水中，待完全溶解后，再加热至沸腾lOmin，稍冷却后，按浓度37.3 mg/L Na.C1(lH16N208.2H20.2H20计算每升所需质量，将其溶解于配好的FeS04.7Η20的溶液中，待完全溶解后再加热至沸腾lOmin，待溶液冷却后，再将该溶液转移至溶有常量元素和微量元素的混合液中；
再按质量浓度4%鹿糖、100mg/L肌醇、1 mg/L烟酸、1 mg/L VB6和1 mg/L VBi计算每升所需质量，将其先后溶于溶有常量元素及微量元素的混合液中，待所有试剂都充分溶解完后，进行定容，定溶过程中用CH3C00H和NaHC03调节溶液pH值5.0 — 5.5范围内，即得到不同氮素浓度含量的培养液；
培养液高压
将配制好的培养液分装在配有棉塞的250ml广口瓶中，每瓶溶液为200ml，经1.5KPa高压灭菌120min，在温度4°C下保存，为保证高压锅内为真空状态以达到培养液的灭菌效果，当气压上升到0.5KPa时需慢慢打开放气阀放气，直至气压指针指向0，然后关闭放气阀，等到气压指示表达到设定气压后，开始计时；瓶口上棉塞的松紧对于后期植株的放置有较大影响，棉塞太紧，在放置植株时会将茎杆压破；棉塞太松，会让空气进入培养液内，引起培养液污染，制作棉塞时，以放置在广口瓶的棉塞能插入食指而没有压迫感和松弛感为标准；麦穗选择和预处理
选择拔节或孕穗期性状一致的主穗，即旗叶和倒二叶的叶距为8-lOcm的麦穗，用剪刀从植株基部剪下，将剪下的主穗置于净水中带回室内，然后剪去下部各叶，保留旗叶和各叶叶鞘，用质量0.l%HgCl消毒植株茎杆15min并用无菌水冲洗三次；
麦穗的离体培养
将消毒后的麦穗通过棉塞插入装有经过高压灭菌的培养液的广口瓶中，每5穗一瓶，置于培养室内培养，光源为日光灯，光照10小时/天，温度为20-25°C，室内用空调保证恒温和空气流畅；
培养过程中，尤其是在灌浆前，植株对培养液的吸收量很大，需密切关注植株对培养液的吸收，植株对培养液的吸收量超过所加液体的70%，即培养瓶中的液体下降至1/3位置时，立即添加培养液；因为培养液中含有有机物，为防止培养液污染，每7-10天更换一次培养液，添加或更换培养液时，需在无菌操作台进行，保证整个过程的无菌操作，防止污染培养液，同时，须剪去麦穗茎杆基部l-2cm，用质量0.l%HgCl消毒和高压后的无菌水将茎杆冲洗干净，重新置入添加培养液的广口瓶中，减少培养液的污染几率。
[0014]研究分析结果:
氮素营养对于小麦麦穗的生长发育具有重要作用，在0-15mmol/L之间，当氮素浓度增加时，小麦的粒数和粒重明显增加，但当氮素浓度超过15mmol/L后，随着氮素浓度增加，小麦麦穗粒数和粒重变化不显著。
[0015]按实施例所述的方法，该方法中的小麦可替换成大麦、黑麦、燕麦、玉米或水稻从拔节或抽穗至完熟整个过程的禾本科植物离体培养。
【权利要求】
1.一种禾本科植物离体培养方法，其特征在于按下列步骤进行: a、按常规方法配制含有常量元素N、P、K、Ca、Mg，微量元素Fe、Mn、B、Mo、Cu、Co、Na和有机物蔗糖、烟酸、肌醇、维生素B6和维生素B1的培养液； b、将配制好的培养液置于配有棉塞的广口瓶中，经1.5KPa高压灭菌120min，在温度4°C下保存； C、于拔节期或孕穗期选择性状一致的主植株为旗叶和倒二叶的叶距为8-lOcm的主穗，用剪刀从基部剪去，置于净水中带回室内； d、去掉下部各叶，保留旗叶和各叶叶鞘，用0.l%HgCl消毒15min，并经三次无菌水冲洗后，通过棉塞插入装有步骤b经过高压的液体培养基的广口瓶中，每5穗一瓶，室内培养，光源为日光灯，光照10小时/天，培养温度为20 - 250C ； e、培养过程中，密切关注植株对培养液的吸收,待植株对培养液的吸收量超过所加液体的70%，立即添加培养液，为防止培养基污染，每7-10天更换一次培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a培养液各组分的浓度含量为:常量元素中 7.8 mmol/L NH4NO3U.66mmol LK2SO4,2.5mmol/L ΚΗ2Ρ04、0.2mmol/L CaSO4.2Η20 和0.3mmol/L MgSO4.7Η20 ;微量元素中 27.8mg/L FeSO4.7Η20、37.3 mg/L Na.C10H16N2O8.2Η20、16.9 mg/L MnSO4.Η20、6.2 mg/L H3BO3>0.83 mg/L ΚΙ、0.25 mg/L Na2MO4.2Η20、0.25 mg/L CuSO4.5H20 和 0.025 mg/L CoCl.6H20 ;有机物为 4% 蔗糖、lOOmg/L 肌醇、I mg/L 烟酸、Img/L VB6和 I mg/L VB10
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法适用于小麦、大麦、黑麦、燕麦、玉米和水稻从拔节或抽穗至完熟整个过程的禾本科植物离体培养。
【文档编号】A01H4/00GK104273035SQ201410572124
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】周洪华, 李卫红 申请人:中国科学院新疆生态与地理研究所