金边玉簪的组织培养快繁方法
【专利摘要】本发明涉及一种金边玉簪的组织培养快繁方法，解决此品种分株繁殖速度较慢，增殖系数极低的生产问题，该方法包括以下的步骤：1)外植体的选择；2)外植体灭菌；3)外植体初代培养；4)增殖培养；5)壮苗培养；6)生根培养；7)移栽驯化。本发明以植株基部分化芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6-苄胺基嘌呤(6BA)，吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立金边玉簪再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4-6周，增殖系数控制在4-6倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种的开发和利用提供科学、有效的繁殖方法，满足生产需求进行产业化生产。
【专利说明】金边玉簪的组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种金边玉簪的组织培养快繁方法。
技术背景
[0002]金边玉簪为百合科、玉簪属多年生草本宿根花卉，花白色或紫色，耐寒、耐荫，在浓荫通风处生长茂盛，是园林中林下地被植物，岩石园等处的重要的绿化材料。引自美国的金边玉簪是近年来园林绿化的新品种，备受人们喜爱，其叶片质地厚、有黄边相嵌，白色的花朵带着香气，既是极好的园林景观花卉，又是极具开发前景的药用植物。由于金边玉簪种子繁殖后代性状易发生变化，又需要三年才能开花；此品种生长较慢，分株繁殖速度较慢，增殖系数极低，每年仅能增殖2-4倍，极大地影响金边玉簪的生产与应用，因此周年生产受阻。
【发明内容】
[0003]本发明以优化再生体系为目的，以保持遗传稳定性为核心，提供一种金边玉簪高效再生体系建立的方法，以解决现在金边玉簪种子繁殖变异大、分株繁殖速度慢、不能满足产业化需求的问题。
[0004]本发明的技术方案为:一种金边玉簪植株再生体系建立的方法，所述再生体系建立方法是通过植株侧芽为外植体，分化出不定芽，经增殖、壮苗、生根、移栽驯化方法培育出小植株，本发明方法提高无菌苗分化率，增殖速度快，生根率高，驯化成活率高，为保持金边玉簪原有优良属性及规模化生产提供可靠的技术，其特征在于包括以下几个步骤:
[0005]I)外植体的选择:春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下；
[0006]2)外植体灭菌:切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟,用滤纸吸干；加入质量百分比浓度1%。氯化萊溶液,加2滴吐温20(Tween20)浸泡，量至漠过外植体材料，摇晃，8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干；
[0007]3)初代培养:将消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基(MS)上，培养20-30天。培养室内为22-25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，Lux为:照度的国际单位；
[0008]4)增殖培养:将初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4_6周后，所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.lmg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复培养；培养室内为22-25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)；
[0009]5)壮苗培养:将长到l-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基(MS)中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗可直接转入生根培养基中。培养室内22-25°C，光14小时，黑10小时，光照强度为1800?2000 勒克斯(Lux)；
[0010]6)生根培养:将在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，所述培养基构成为:基本培养基(MS培养基中大量元素含量减半)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)、lmg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L,于24_26°C，光12小时，黑12小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，培养1_2周；
[0011]7)驯化移栽:待根长l-2cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜I天。调水温20-22°C，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩:蛭石体积比2:1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
[0012]本发明采用组织培养技术，建立其高效再生体系，能够保持原品种优良性状，快速提高繁殖速度，满足生产需求进行产业化生产。本发明从外植体选择、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及驯化移栽方法，建立了一套完整的金边玉簪植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，直接分化不定芽，不定芽分化率达100 %，一代增殖系数为5.3，生根率达到90.12%，移栽成活率达92%以上。本发明以植株基部分化芽为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸(NAA)、6_苄胺基嘌呤(6BA)，吲哆丁酸(IBA)激素调节，建立金边玉簪再生体系的方法。该发明一个增殖继代周期为4-6周，增殖系数控制在4-6倍，且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，为该品种的开发和利用提供科学、有效的繁殖方法，满足生产需求进行产业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1增殖培养示意图
[0014]图2壮苗培养示意图
[0015]图3生根培养示意图
[0016]图4移栽驯化示意图
【具体实施方式】
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[0017]本发明实施的条件:无菌接种室、无菌培养室、过渡培养室、温室。
[0018]本发明的实质是:新生植株保持健康母本的遗传性状,再生植株品质好,繁殖系数大。
[0019]一种金边玉簪植株再生体系建立的方法，通过植株侧芽为外植体，分化出不定芽，经增殖、壮苗、生根、移栽驯化方法培育出优良小植株，具体步骤如下:
[0020]I)外植体的选择:春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下；
[0021]2)外植体灭菌:切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟,用滤纸吸干；加入质量百分比浓度1%。氯化萊溶液,加2滴吐温20(Tween20)浸泡，量至漠过外植体材料，摇晃，8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干；
[0022]3)初代培养:将步骤2)消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基(MS)上，培养20-30天。培养室内为22-25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，Lux为:照度的国际单位；
[0023]4)增殖培养:将步骤3)初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4-6周后，每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复培养；培养室内为22-25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)；
[0024]5)壮苗培养:将步骤4)长到l_2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基(MS)中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗可直接转入生根培养基中。培养室内22-25°C，光14小时，黑10小时，光照强度为1800 ?2000 勒克斯(Lux)；
[0025]6)生根培养:将步骤5)在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，于24-26°C，光12小时，黑12小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，培养基中加入活性炭，提供局部黑暗环境，缩短生根时间；
[0026]7)驯化移栽:待步骤6)根长l-2cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜I天。调水温20-22°C，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩:蛭石体积比2:1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
[0027]基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L 的氯化钙(CaCl2.2H20)，370mg/L 的硫酸镁(MgSO4.7H20)，1650mg/L 的硝酸铵(NH4 NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4.H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取 19000mgKN03>4400mgCaCl2.2H20、3700mgMgS04.7H20U6500mgNH4 N03、1700mgKH2PO4.H2O,分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取大量元素母液10ml ;微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4.4H20)，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L 的硫酸锌(ZnSO4.7H20),0.25mg/L 的钥酸钠(Na2M0O4.2H20),0.025mg/L 的硫酸铜(CuSO4.5H20),0.025mg/L 的氯化钴(CoCl2.6H20),0.83mg/L 的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液 1L，100 倍量，分别取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20，25mgNa2Mo04.2H20, 2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20，83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取微量元母液1ml ;铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4.7H20)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20，分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置IL培养基取铁盐溶液1ml ;有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸，0.5mg/L的盐酸吡哆醇，0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成，配置有机物母液1L，分别取50mg的烟酸，50mg的盐酸卩比B多醇,40mg的盐酸硫胺素，200mg的甘氨酸，1000mg的肌醇，分别溶解，混合后定容至1L，每配置IL培养基取有机物母液1ml ;蔗糖30g/L，琼脂粉58/1，？!1值5.8?6.2。
[0028]如图1所示，培养20-30天。培养室内为22_25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，不定芽分化率达100%。
[0029]如图2所示，丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基(MS)中，培养3-4周，培养室内22-25。。，光14小时，黑10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，一代增殖系数为5.3。
[0030]如图3所示，在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，于24-26°C，光12小时，黑12小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，培养1_2周，生根率达到90.12%。
[0031]如图4所示，在珍珠岩:蛭石体积比2:1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，移栽成活率达92%以上。
[0032]如图1、图2、图3、图4所示，本发明从外植体选择、消毒方法、初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养及驯化移栽方法，建立了一套完整的金边玉簪植株再生体系，确定了组培繁殖培养基配方，直接分化不定芽，不定芽分化率达100%，一代增殖系数为5.3，生根率达到90.12%，移栽成活率达92%以上。
【权利要求】
1.一种金边玉簪的组织培养快繁方法，其特征是:包括以下几个步骤: 1)外植体的选择:春季，选择健康植株萌发出来的嫩芽，用锋利刀片切下； 2)外植体灭菌:切去叶片的2/3，先用自来水洗净后，加适量洗洁精自来水冲洗30-40分钟，用滤纸吸干；加入质量百分比浓度1%。氯化汞溶液,加2滴吐温20(Tween20)浸泡,量至漠过外植体材料,摇晃,8-10分钟后倒掉消毒液，然后，用无菌水冲洗外植体材料3-5次，表面没有泡沫后，吸干； 3)初代培养:将消毒好的外植体切去边缘，插于基本培养基(MS)上，培养20-30天。培养室内为22-25。。，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，Lux为:照度的国际单位； 4)增殖培养:将初代培养外植体材料，转接于MS+NAA0.1+6BA2培养基上培养4_6周后，所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.lmg/L萘乙酸(NAA)和2mg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复培养；培养室内为22-25°C，光14小时，黑暗10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)； 5)壮苗培养:将长到l-2cm长的丛生芽剪切后移入壮苗培养基基本培养基(MS)中，培养3-4周，无菌苗长到2-4cm高度即可转入生根培养基中，增殖培养中的较大的无菌苗可直接转入生根培养基中。培养室内22-25°C，光14小时，黑10小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)； 6)生根培养:将在壮苗培养基中无菌苗转接至生根培养基1/2MS+NAA0.5+IBA1+活性炭，所述培养基构成为:基本培养基(MS培养基中大量元素含量减半)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)、lmg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L,于24_26°C，光12小时，黑12小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，培养1-2周； 7)驯化移栽:待根长l-2cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜I天。调水温20-22°C，洗去无菌苗根部的培养基，移入含有珍珠岩:蛭石体积比2:1的基质中，在保湿保温条件下进行驯化培育，逐步降低湿度、温度，30天后，计算成活率。
2.根据权利要求1所述的一种金边玉簪的组织培养快繁方法，其特征是:基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3)，440mg/L的氯化钙(CaCl2.2H20)，370mg/L 的硫酸镁(MgSO4.7H20)，1650mg/L 的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4.H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取19000mgKN03、4400mgCaCl2.2H20、3700mgMgS04.7H20、16500mgNH4N03、1700mg KH2PO4.H2O,分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取大量元素母液10ml ;微量元素由体积百分比浓度为 22.3mg/L 的硫酸锰(MnSO4.4H20)，6.2mg/L 的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L 的硫酸锌(ZnSO4.7H20),0.25mg/L 的钥酸钠(Na2M0O4.2H20),0.025mg/L 的硫酸铜(CuSO4.5H20)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2.6H20), 0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液1L，100 倍量，分别取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20，25mgNa2Mo04.2H20,2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20,83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取微量元母液1ml ;铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4.7Η20)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20,分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置IL培养基取铁盐溶液1ml ;有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸,0.5mg/L的盐酸卩比卩多醇,0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成,配置有机物母液1L,分别取50mg的烟酸,50mg的盐酸卩比B多醇，40mg的盐酸硫胺素,200mg的甘氨酸，1000mg的肌醇,分别溶解,混合后定容至1L,每配置IL培养基取有机物母液1ml ;蔗糖30g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8?6.2。
【文档编号】A01H4/00GK104304035SQ201410649001
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】曲彦婷, 唐焕伟, 张冬青, 张兴, 李黎, 陈菲, 韩辉, 刘淑艳, 张鹏远, 熊燕, 梁鸣 申请人:黑龙江省科学院自然与生态研究所