一种促进人工栽培铁皮石斛生长的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及铁皮石斛研究与开发应用的技术，特别涉及促进人工栽培铁皮石斛生长的方法。
【背景技术】
[0002]石斛属(Dendrobium)是兰科(Orchidaceae)植物中的第2大属，迄今已发现全球有1500多个种，我国有70多个种[宋经元，郭顺星.近10年来石斛属植物的研究进展.中国药学杂志，2004，39 (10):25 ?27]。其中，以铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ExLindl.)为代表的一些品种是我国传统的名贵中药材，在《本草纲目》等古医书中被列为上品。现代科学研究与临床实践证明，石斛药材除具有如古医书记载的滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎等功效外，还具有显著的抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗血栓、抗血小板凝集及增强机体免疫力等功效。近年来石斛药材的需求量不断增加，而石斛属植物的生境较为独特，自然繁殖率低，导致天然石斛无序采集，野生资源锐减，部分石斛品种已濒临灭绝。近10多年来，石斛人工栽培技术取得了很大发展，并已实现大面积推广与商业化应用。但如铁皮石斛等一些名贵品种在人工栽培条件下从组培苗到成品采摘仍需2年多的时间。若使用生长激素等化学物质，虽可明显加快生长、缩短生产周期，但产品的品质及食用安全性等却受到严重影响。石斛属植物与其它附生兰科植物一样，其根群不与土壤接触(即生不入土)，而是附着在树的枝干或岩石上生长，利用雨露、空气中的水汽及有限的腐殖质(腐烂的枯枝残叶或动物排泄物等)为生，它们对生态环境的要求十分严格，高温高湿的热带雨林通常是它们生长、繁殖的最佳环境[张绍云，马伟光，尚建华等.思茅地区石斛属植物资源的调查.云南中医学院学报.2005，28 (I):24?27]。为此，迫切需要通过研究为人工栽培铁皮石斛建立类似其野生生长环境的模式，以促进当前人工栽培铁皮石斛产量和品质的提升。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，目的是提供一种促进人工栽培铁皮石斛生长的新方法。
[0004]为解决技术问题，本发明的方案是:
[0005]提供一种促进人工栽培铁皮石斛生长的新方法，包括以下步骤:
[0006](I)将50g野生或人工栽培铁皮石斛新鲜茎段剪成约Icm的小段并置于研钵内，加入50ml Basal培养液[陈峰，姜悦主编.微藻生物技术.中国轻工业出版社，1999，P61]并充分研碎，将研碎物转入100ml烧瓶中，加入600ml Basal培养液并用玻璃棒充分搅拌直至块状物散开，置于50°C恒温水浴中保温4h，期间不时搅拌；
[0007](2)将⑴中的保温液用100目尼龙筛絹过滤，再用300ml Basal培养液润洗烧瓶及筛絹上的滤渣，将滤液用Basal培养液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生铁皮石斛附生藻培养液，记为DCA-M ;
[0008](3)用浸蘸DCA-M的棉签轻拭野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5ml DCA-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛絹过滤；
[0009](4)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度25°C，光照40 μπιο?.m 2.s /待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD 56。至0.1，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD56。达0.8的藻液达10ml ；
[0010](5)将上述OD56。达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以8000?12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液后即得藻泥；
[0011](6)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为40°C、相对湿度RH为20%、光照强度40 μπιο?.m2.s 1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用10ml的DCA-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度25°C、光照40 μ mol.m 2.s 1的恒温光照培养箱，过1d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长；
[0012](7)待(6)中的藻液OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD 56。至0.1继续放大培养，直至OD56。达0.8的藻液达100ml ；
[0013](8)将(7)中OD56。达0.8的藻液用Basal培养液稀释使OD 56。至0.4后继续放大培养，直至获得需要的量；
[0014](9)用喷雾器将(8)中培养OD56。达0.8的藻液以32L/亩的用量喷施于新栽种的铁皮石斛苗上，过3周再如上用量喷施I次，约过6周后即可见栽种铁皮石斛的茎及基质松鳞和碎石上有藻长出，这些藻可起到保湿抗旱，并为铁皮石斛提供部分养分等作用，而能显著促进人工栽培铁皮石斛的生长速度。
[0015]作为一种改进，所述在高速离心机上的离心速率为lOOOOrpm，离心时间为lOmin。
[0016]本发明的有益效果在于:
[0017]本发明研制野生铁皮石斛附生藻培养液DCA-M含铁皮石斛多糖等产物及甘油，其渗透压和营养价值均高于仅以无机元素配制的Basal培养液，以适应野生铁皮石斛附生藻离体液体培养的需要；以将初步分离的附生藻置于高温干燥环境下进行压力筛选，可获得保湿耐旱的附生藻；在附生藻后期扩大培养中改用Basal培养液对藻液进行成倍稀释，是为让藻液的渗透压和营养物不要降得太低，以满足附生藻生长需要且减低培养液的成本。这种方法具有操作简便、成本低、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点。
【附图说明】
[0018]图1为从野生铁皮石斛茎上分离的部分附生藻；
[0019]图2为经高温、干燥处理后恢复生长的附生藻；
[0020]图3为人工栽培铁皮石斛喷施附生藻8个月后的促生长效果，A未喷施附生藻、B喷施附生藻。
【具体实施方式】
[0021]本发明的技术方案可以通过以下步骤实现。
[0022]实例1:
[0023]选用样本材料:野生新鲜铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)采自云南思茅，可到云南思茅采集，也可于每年5-10月份在杭州凤起花鸟市场、杭州吴山广场花鸟市场等市场购买。
[0024]试剂和仪器:本发明中所用的培养液成分均为国产分析纯。CH-30光学显微镜为日本OLYMPUS生产；Ultrospec 2000型紫外-可见分光光度计为美国Pharmacia公司生产；TE214S型电子天平为北京赛多利斯生产；TGL-16A高速离心机为长沙平凡仪器仪表公司生产。
[0025]分离促进人工栽培铁皮石斛生长的附生藻及其喷施方法的主要步骤如下:
[0026](I)将50g采自云南思茅的野生铁皮石斛新鲜茎段剪成约Icm的小段并置于研钵内，加入50ml Basal培养液并充分研碎，将研碎物转入100ml烧瓶中，加入600ml Basal培养液并用玻璃棒充分搅拌直至块状物散开，置于50°C恒温水浴中保温4h，期间不时搅拌；
[0027](2)将⑴中的保温液用100目尼龙筛絹过滤，再用300ml Basal培养液润洗烧瓶及筛絹上的滤渣，将滤液用Basal培养液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生铁皮石斛附生藻培养液，记为DCA-M ;
[0028](3)用浸蘸DCA-M的棉签轻拭云南思茅的野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5ml DCA-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，取样于显微镜下观察野生铁皮石斛附生藻的种类如附图1所示，有小球藻、栅藻、硅藻、舟形藻等；
[0029](4)用100目的尼龙筛絹过滤步骤(3)中的藻样，滤液置恒温光照培养箱中培养，温度25°C，光照40 ymol -1n2-S /待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD56。至0.1，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD 56。达0.8的藻液达10ml ；
[0030](5)将上述OD56。达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以1000rpm的转速离心lOmin，小心倾去上清液后即得藻泥；
[0031](6)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为40°C、相对湿度RH为20%、光照强度40μπιΟ1.πι2.s 1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用10ml的DCA-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度25°C、光照40 μ mol.m 2.s 1的恒温光照培养箱，过1d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的小球藻和栅藻能恢复生长，说明它们具有良好的保湿和耐旱能力，详见附图2 ;
[0032](7)待(6)中的藻液OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD 56。至0.1继续放大培养，直至OD56。达0.8的藻液达1000ml ；
[0033](8)将(7)中OD56。达0.8的藻液用Basal培养液稀释使OD 56。至0.4后继续放大培养，直至获得需要的量；
[0034](9)用喷雾器将⑶中培养OD56。达0.8的藻液以16L/亩的用量喷施于浙江上虞浙东生态农业开发有限公司2013年底新栽种的铁皮石斛苗上，过3周再如上用量喷施一次，约过6周后即可见栽种铁皮石斛的茎及基质松鳞和碎石上有藻长出，附图3为2014年8月人工栽培铁皮石斛喷施附生藻与否的比较图，可见，这些藻可起到保湿抗旱，并为铁皮石斛提供部分养分等作用，能显著促进人工栽培铁皮石斛的生长，产量可提高I倍以上。
[0035]实例2:选取杭州健港生物科技有限公司浙江省建德市基地的人工栽培新鲜铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)为样本，利用本发明的方法配制DCA-M，从采自浙江雁荡山的野生铁皮石斛茎上也分离到以小球藻和栅藻为优势种的附生藻，并将附生藻藻体培养后用于浙江大学湖州现代农业示范基地的人工栽培铁皮石斛，也起到了增产近I倍的效果。
[0036]实例3:选取选取杭州小香生态农业科技有限公司浙江省建德市基地的人工栽培新鲜铁皮石斛(Dendrobium candid Wall.Ex Lindl.)为样本，利用本发明的方法配制DCA-M，从采自福建武夷山的野生铁皮石斛茎上也分离到以小球藻和栅藻为优势种的附生藻，并将附生藻藻体培养后用于浙江海兴生物科技有限公司武义基地的人工栽培铁皮石斛，也起到了增产近I倍的效果。
【主权项】
1.促进人工栽培铁皮石斛生长的方法，包括以下步骤: (1)将50g野生或人工栽培铁皮石斛新鲜茎段剪成约Icm的小段并置于研钵内，加入50ml Basal培养液并充分研碎，将研碎物转入100ml烧瓶中，加入600ml Basal培养液并用玻璃棒充分搅拌直至块状物散开，置于50°C恒温水浴中保温4h，期间不时搅拌； (2)将(I)中的保温液用100目尼龙筛絹过滤，再用300mlBasal培养液润洗烧瓶及筛絹上的滤渣，将滤液用Basal培养液定容至1000ml，并加入2ml甘油，即配制成野生铁皮石斛附生藻培养液，记为DCA-M ； (3)用浸蘸DCA-M的棉签轻拭野生新鲜铁皮石斛茎上的藻斑，尔后将棉球放入盛有5mlDCA-M的50ml烧杯中润洗，重复轻拭-润洗10次，直至烧杯中的藻液呈淡绿色，并用100目的尼龙筛絹过滤； (4)将滤得的藻液置恒温光照培养箱中培养，温度25°C，光照40μπιο?.m 2.s /待藻液在分光光度计波长560nm处的光密度OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD 56。至0.1，在上述条件下继续放大培养，如此反复，直至OD56。达0.8的藻液达10ml ； (5)将上述OD56。达0.8的藻液转入高速离心机的离心管中以8000?12000rpm的转速离心10-15min，小心倾去上清液后即得藻泥； (6)将上述藻泥均匀涂于直径为7cm的玻璃培养皿中，置于温度为40°C、相对湿度RH为20%、光照强度40μπιΟ1.πι2.s 1的人工光照气候箱中处理12d后，取出并用10ml的DCA-M润洗后转入250ml的三角瓶中置于温度25°C、光照40 μπιο?.m 2.s 1的恒温光照培养箱，过1d后发现变绿，取样于显微镜下观察发现野生铁皮石斛附生藻中的部分藻能恢复生长; (7)待(6)中的藻液OD56。达0.8时，用DCA-M稀释使OD 56。至0.1继续放大培养，直至OD56。达0.8的藻液达100ml ； (8)将(7)中OD56。达0.8的藻液用Basal培养液稀释使OD 56。至0.4后继续放大培养，直至获得需要的量； (9)用喷雾器将(8)中培养OD56。达0.8的藻液以32L/亩的用量喷施于新栽种的铁皮石斛苗上，过3周再如上用量喷施I次，约过6周后即可见栽种铁皮石斛的茎及基质松鳞和碎石上有藻长出，这些藻可起到保湿抗旱，并为铁皮石斛提供部分养分等作用，而能显著促进人工栽培铁皮石斛的生长速度。2.根据权利要求1所述促进人工栽培铁皮石斛生长的方法，其特征在于，所述在高速离心机上的离心速率为lOOOOrpm，离心时间为lOmin。
【专利摘要】本发明涉及铁皮石斛研究与开发应用，旨在提供一种促进人工栽培铁皮石斛生长的方法。该方法是在Basal培养液中加入铁皮石斛多糖等产物及甘油，配制成野生铁皮石斛附生藻的培养液DCA-M；从野生铁皮石斛茎上分离附生藻，并经高温干燥环境下进行压力筛选，获得保湿耐旱性能好的附生藻；对附生藻进行培养并喷施于人工栽培的铁皮石斛苗，可起到显著的促生长作用。本发明方法与传统促生长方法相比，具有操作简便、成本低、效果明显、对操作人员的专业技术无特殊要求、应用性强等优点，可为人工栽培铁皮石斛高产、优质生产等提供必要的技术方法。
【IPC分类】A01G33/00, A01G31/00, C05F11/00
【公开号】CN105706868
【申请号】CN201510084355
【发明人】汪凡越
【申请人】汪凡越