治疗植物疾病的组合物和方法与流程

发明领域

本文公开了用于治疗植物疾病例如柑橘绿化病(citrusgreeningdisease)的纳米颗粒组合物和方法。

相关技术

许多类型的植物病害威胁到世界粮食供应。其中最具破坏性的是柑橘绿化病，其影响柑橘树，主要是橙树。对柑橘绿化病没有治愈并且控制疾病的努力进展缓慢，因为感染的柑橘植物难以维持、再生和研究。唯一已知的解决方案是用杀虫剂喷洒树木，以杀死传播疾病的昆虫。2014年6月，美国农业部拨出3150万美元用于研究，以帮助打击柑橘绿化病。

柑橘绿化病的特征在于柑橘植物的脉络和邻近组织发黄的常见症状，随后是整个叶的黄化或斑驳，随后是过早脱叶，树枝枯萎，觅食根和侧根腐烂，活力下降。最后是整颗植物死亡。受影响的树木生长发育迟缓，多次淡季开花(大部分脱落)，并产生小而不规则形状的果实，皮厚且淡，底部保持绿色。这些树上的水果味苦。

柑橘绿化病由媒介传播的病原体引起。致病因子是运动性细菌，韧皮部杆菌属(candidatusliberibacterspp)。传播是通过昆虫：亚洲柑橘属木虱(腹吻亚目(sternorrhyncha)：木虱科(psyllidae))，diaphorinacitri，或在非洲，是通过triozaerytreae，非洲柑橘属木虱，也称为2斑点柑橘木虱。该疾病于1929年首次被描述，并于1943年首次在中国报道。非洲变种在1947年首先在南非报道，在南非仍然普遍存在。

致病因子是薄壁菌门(gracilicutes)进化枝中的、难养韧皮部限制的(fastidiousphloem-restricted)革兰氏阴性细菌。亚洲形式，l.asiaticus，是耐热的。这意味着绿化症状可以在高达35℃的温度下发展。非洲形式，l.africanum，是热敏感的，在这种情况下，仅当温度在20-25℃范围内才会出现症状。细菌通过木虱媒介传播，也通过移植传播。虽然triozaerytreae是非洲柑橘绿化的天然媒介，而diaphorinacitri是亚洲柑橘绿化的天然媒介，然而在实验条件下，任一种木虱实际上可以传播任一种绿化剂。

农业研究机构的研究人员已经使用感染柑橘绿化病的柠檬树感染长春花植物，以试图研究该疾病。长春花植物很容易感染这种疾病，并且当用抗生素进行实验治疗时，反应良好。研究人员正在基于当应用于感染的长春花时观察到的初步结果测试青霉素g钠和杀生物剂2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺作为受感染柑橘植物的潜在治疗的效果。

柑橘绿化病的分布主要在亚洲的热带和亚热带。除了日本以外，在亚洲所有柑橘种植地区都有报道。这种疾病已经对中国大陆、台湾、印度、斯里兰卡、马来西亚、印度尼西亚、缅甸、斯里兰卡、菲律宾、巴基斯坦、泰国、琉球群岛、尼泊尔、沙特阿拉伯和阿富汗的农作物造成影响。亚洲以外的地区也报道了这种疾病：留尼旺(réunion)、毛里求斯、巴西和佛罗里达(自1998年以来)，以及自2009年以来在墨西哥的几个城市。2012年3月30日，在加利福尼亚州哈仙达岗(haciendaheights)的一棵柑橘树中证实了柑橘绿化病。加利福尼亚无处不在的后院柑橘果园的前景暗淡，因为住宅种植者不太可能一直使用在商业果园中提供有效控制的农药。

自从该疾病在佛罗里达市和homestead被发现，已经扫荡了90,000英亩的柑橘园。喷洒杀死部分木虱的成本很高，正在推动一些种植者走向金融危机。生产一英亩橙子的平均成本为1,800美元，几乎是1995年的两倍。2012年分析估计，该疾病花费了种植者46亿美元，造成约8000个工作岗位的损失。

在佛罗里达柑橘的全盛时期，1970年左右，种植橙、葡萄柚和特色果园的英亩数超过90万。据报道，今天，这个数字稍多于50万英亩。

因此，出现了一种渴望寻求治愈柑橘绿化病的长期而不满意的需求。鉴于美国大量柑橘树已被摧毁，寻求治愈柑橘绿化病的方法的需要尤其急迫。尽管有许多尝试控制这种疾病，但是没有一个特别有效，没有一个实际上提供可靠的治疗。

技术实现要素：

本文公开的是用于治疗由诸如细菌和真菌的病原体引起的植物疾病的纳米颗粒组合物和方法，所述植物疾病包括但不限于感染柑橘类植物的柑橘绿化病。还公开了制备纳米颗粒组合物的方法。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含(1)可施用于植物部分的载体和(2)多个金属纳米颗粒。作为示例，纳米颗粒可以是固体球形金属纳米颗粒和/或珊瑚状金属纳米颗粒，其中每个珊瑚状金属纳米颗粒具有不均匀的横截面和由连接在一起而没有直角的多个非线性链形成的球形结构。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含球形金属纳米颗粒，其具有的浓度在约10ppb至约100ppm，或约0.5ppm至约100ppm范围内，具有的平均粒度在约2nm至约25nm，并且具有的粒度分布使得至少99％的金属纳米颗粒具有在平均粒度的30％以内的粒度。此外，纳米颗粒组合物还可以包含可以增强球形金属纳米颗粒的活性的珊瑚状金属纳米颗粒。

在一些实施方案中，金属纳米颗粒可以包含选自金、铂、银、钯、铑、锇、钌、铑、铼、钼、铜、铁、镍、锡、铍、钴、锑、铬、锰、锆、锡、锌、钨、钛、钒、镧、铈、其异质混合物及其合金中的至少一种非离子的基态(groundstate)金属。

在一些实施方案中，治疗植物疾病的方法包括：(1)将包含载体和金属纳米颗粒的纳米颗粒组合物施用于植物部分；和(2)纳米颗粒组合物杀死或变性植物或植物部分中的微生物。作为示例，植物疾病是柑橘绿化病，并且纳米颗粒组合物杀死导致柑橘绿化病的细菌。

在一些实施方案中，治疗植物疾病的方法包括：(1)去除患病植物部分；(2)通过将纳米颗粒组合物施用到患病植物部分上或其中来处理植物部分；和(3)将经处理的植物部分移植回植物上。作为示例，植物包括柑橘树且患病植物部分包含柑橘树分枝。有利地，金属纳米颗粒选择性地杀死引起柑橘绿化病或其它植物病害的细菌，而不会伤害到可能接触经处理的柑橘树或者吃暴露于金属纳米颗粒的柑橘类果实的人。

本发明的这些和其他优点和特征将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地在对后面审查时对本领域的技术人员变得显而易见或者可以通过本发明的实践中了解。

附图说明

图1是用于制备用于治疗植物疾病的纳米颗粒组合物的示例性球形金属纳米颗粒的透射电子显微镜图像(tem)，所述纳米颗粒具有基本均匀的尺寸和窄的粒度分布；

图2a-2e是用于制备用于治疗植物疾病的纳米颗粒组合物的示例性珊瑚状金属纳米颗粒的透射电子显微镜图像(tem)；

图3示意性地示出了吸收球形金属纳米颗粒之后的微生物；

图4示意性地示出了二硫键被相邻的球形纳米颗粒催化变性的微生物蛋白质；和

图5示意性地示出了具有二硫键的哺乳动物蛋白质，所述二硫键被屏蔽以便抵抗被相邻的球形纳米颗粒催化变性。

优选实施方案的详细描述

本发明公开了用于治疗植物疾病的纳米颗粒组合物和用于治疗植物疾病的方法。在一些实施方案中，金属纳米颗粒分散在载体内或包含在载体上或载体内，所述载体可以施加到植物或植物部分上或其中。载体可以是液体、凝胶或固体。纳米颗粒组合物可以配制用于治疗柑橘绿化病和其它疾病，例如由微生物引起的疾病。

纳米颗粒构型

在一些实施方案中，金属纳米颗粒可以包含或基本上由非离子的基态金属纳米颗粒组成。实例包括球形金属纳米颗粒、珊瑚状金属纳米颗粒或球形金属纳米颗粒和珊瑚状金属纳米颗粒的共混物。

在一些实施方案中，可用于制备纳米颗粒组合物的金属纳米颗粒包含球形纳米颗粒，优选具有固体芯的球形金属纳米颗粒。术语“球形金属纳米颗粒”是指由一种或多种金属制成的纳米颗粒，优选非离子的基态金属，其仅具有内部键角并且没有外部边缘或键角。以这种方式，球形纳米颗粒具有很强的电离抗性，高度稳定性，并且具有很强的抗附聚性。这样的纳米颗粒可以表现出高ξ电位，这允许球形纳米颗粒保持分散在极性溶剂中而无需表面活性剂，这是令人惊讶和预期的结果。

在一些实施方案中，球形金属纳米颗粒可以具有约40nm或更小，约35nm或更小，约30nm或更小，约25nm或更小，约20nm或更小，约15nm或更小，约10nm或更小，约7.5nm或更小，或约5nm或更小的直径。

在一些实施方案中，球形纳米颗粒可以具有这样的粒度分布，其使得至少99％的纳米颗粒的直径在纳米颗粒平均直径的30％内，或在平均直径的20％内，或在平均直径的10％内。在一些实施方案中，球形纳米颗粒可以具有平均粒度，并且至少99％的纳米颗粒具有的粒度在平均直径的±3nm以内，平均直径的±2nm以内或平均直径的±1nm以内。在一些实施方案中，球形纳米颗粒可以具有至少10mv，优选至少约15mv，更优选至少约20mv，甚至更优选至少约25mv，和最优选至少约30mv的ζ电位。

用于制造球形纳米颗粒的方法和系统的实例公开于williamniedermeyer(“niedermeyer公开”)的us专利公开号2013/0001833中，该文献通过引用并入本文。图1是使用niedermeyer公开的方法和系统制造的示例性球形纳米颗粒的透射电子显微镜图像(tem)。所示的纳米颗粒是具有基本均匀尺寸的球形银(ag)纳米颗粒，平均直径约10nm和粒度分布窄。在一些实施方案中，球形纳米颗粒可以具有固体芯而不是中空的，如通常在非金属种子纳米颗粒(例如二氧化硅)的表面上形成的常规金属纳米颗粒的情况那样，其随后被除去产生中空纳米球。

在一些实施方案中，用于制备纳米颗粒组合物的非离子金属纳米颗粒可以包含珊瑚状纳米颗粒。术语“珊瑚状金属纳米颗粒”是指由一种或多种金属制成的纳米颗粒，优选非离子的基态金属，其具有不均匀的横截面和球状结构，所述球状结构由连接在一起而没有直角的多个非线性的链形成。类似于球形纳米颗粒，珊瑚状纳米颗粒可以仅具有内部键角并且没有外部边缘或键角。以这种方式，珊瑚状纳米颗粒可以具有高度的电离抗性，是高度稳定的，并且对附聚具有很高的抵抗力。这样的珊瑚状纳米颗粒可以表现出高ξ电位，这允许珊瑚状纳米颗粒保持分散在极性溶剂中而无需表面活性剂，这是令人惊讶和预期的结果。

在一些实施方案中，珊瑚状纳米颗粒可以具有约15nm至约100nm，或约25nm至约95nm，或约40nm至约90nm，或约60nm至约85nm，或约70nm至约80nm的长度。在一些实施方案中，珊瑚状纳米颗粒可以具有这样的粒度分布，其使得至少99％的纳米颗粒具有的长度在平均长度的30％内，或在平均长度的20％内，或在平均长度的10％内。在一些实施方案中，珊瑚状纳米颗粒可以具有至少10mv，优选至少约15mv，更优选至少约20mv，甚至更优选至少约25mv，和最优选至少约30mv的ζ电位。

用于制造珊瑚状纳米颗粒的方法和系统的实例公开于以williamniedermeyer(“niedermeyer申请”)名义于2014年9月23日提交的us临时申请号62/054,126中，该文献通过引用并入本文。图2a至2e是使用niedermeyer申请的方法和系统制造的示例性珊瑚状金属纳米颗粒的透射电子显微镜图像(tem)。所示的纳米颗粒是珊瑚状金纳米颗粒。

珊瑚状金属纳米颗粒可以代替球形金属纳米颗粒或与球形金属纳米颗粒结合使用。通常，球形金属纳米颗粒可以小于珊瑚状金属纳米颗粒，并且以这种方式可以提供非常高的表面积用于催化所需反应或提供其它期望的益处。另一方面，与球形纳米颗粒相比，通常较大的珊瑚状纳米颗粒每单位质量可以表现出更高的表面积，因为珊瑚状纳米颗粒具有内部空间和表面而不是实芯和仅仅是外部表面。在一些情况下，提供含有球形纳米颗粒和珊瑚状纳米颗粒的纳米颗粒组合物可提供协同的结果。例如，珊瑚状纳米颗粒除了提供自己独特的优点之外，还可以帮助支持和/或增强球形纳米颗粒的活性。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物可以包括球形纳米颗粒和珊瑚状纳米颗粒两者。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的球形纳米颗粒与珊瑚状纳米颗粒的质量比可以在约1:1至约50:1，或约2.5:1至约25:1，或约5:1至约20:1，或约7.5:1至约15:1，或约9:1至约11:1，或约10:1的范围内。纳米颗粒组合物中的球形纳米颗粒与珊瑚状纳米颗粒的颗粒数目比可以在约10:1至约500:1，或约25:1至约250:1，或约50:1至约200:1，或约75:1至约150:1，或约90:1至约110:1，或约100:1的范围内。

金属纳米颗粒，包括球形纳米颗粒和珊瑚状纳米颗粒，可以包括任何所需的金属、金属混合物或金属合金，包括银、金、铂、钯、铑、锇、钌、铑、铼、钼、铜、铁、镍、锡、铍、钴、锑、铬、锰、锆、锡、锌、钨、钛、钒、镧、铈、其异质混合物或其合金中的至少一种。

载体

纳米颗粒组合物还包括用于将金属纳米颗粒递送到植物或植物部分的载体。载体可以是液体、凝胶或固体。一些载体可能比其他载体更适合，这取决于被治疗的植物。例如，可以选择载体的溶解度特征以使在整个被治疗的植物部分和/或与被治疗的植物部分接触的植物的另一部分中的扩散最大化或提供期望的扩散。

可用于配制本文所公开的纳米颗粒组合物的载体的实例包括但不限于水、醇、酮、酯、松节油、柑橘油、精油、植物油、甘油三酯、醚、有机溶剂、甲醇、乙醇、异丙醇、其它醇、二醇、甘油、多元醇、1,3-丙二醇、石油馏分、煤油、蜡、聚合物、可聚合材料和表面活性剂。

本领域已知的凝胶可以用作载体，例如含有一种或多种上述液体组分以及已知的胶凝剂的凝胶。凝胶组合物可以更容易地粘附到被治疗的植物基体上。

固体载体由于不同的原因可以用于例如随着时间的推移将纳米颗粒洗脱到植物或植物部分中。固体载体的实例包括但不限于聚合物、橡胶、弹性体、泡沫和树胶。根据待治疗植物的特征和所需的洗脱速率，本领域技术人员可以选择合适的固体载体材料。

在一些实施方案中，可以配制纳米颗粒组合物，使得包含的金属纳米颗粒的浓度为，当施加到植物或植物部分上或其中时，测定量的纳米颗粒组合物将提供预定浓度或数量的金属纳米颗粒。纳米颗粒组合物可以具有较高浓度的纳米颗粒，当与施用于或天然包含在植物或植物部分中的其它液体混合时，纳米颗粒变得稀释。根据被治疗的植物或植物部分、添加的纳米颗粒的性质和使用的载体类型，纳米颗粒组合物可以含有按重量计约10ppb至约100ppm，或约0.5ppm至约100ppm的金属纳米颗粒，或按重量计约1ppm至约50ppm，或约2ppm至约25ppm，或约3ppm至约20ppm的金属纳米颗粒。

在一些实施方案中，纳米颗粒组合物还可以包括一种或多种任选的组分或佐剂以提供所需的性质，包括但不限于植物营养素、肥料、杀虫剂、杀生物剂和/或矿物质。

在一些实施方案中，载体也可以起稳定剂的作用，或者可以包括稳定剂。例如，在一些实施方案中，可能期望在相同的溶液中具有不同的具体尺寸的纳米颗粒以利用不同颗粒的每一种不同性质和效果。然而，当将不同尺寸的颗粒混合到单一溶液中时，由于施加在各种颗粒上的不平等的力导致颗粒的最终聚集，该单一溶液中的这些颗粒的整体长期稳定性可能会显著降低。当该溶液被加热或冷却到显著高于或低于标准室温条件时，该现象可能变得更加突出。

稳定剂的实例包括醇(例如乙醇、丙醇、丁醇等)、多酚(例如，arjuna树皮提取物、葡萄籽提取物等)、单甘油酯、二甘油酯或甘油三酯(例如葡萄籽油、椰子油等)、油(例如薰衣草)、其他萜烯、胺化合物(例如单-、二-或三-乙醇胺)、碳水化合物(例如蔗糖、果糖)、脂质体、膏剂、其它乳剂和其它聚合物。

在一些实施方案中，将稳定剂以微摩尔至毫摩尔浓度范围溶解在单独的载体中，其中范围上限通常不受功效限制，而是由产品成本限制。

这些各种稳定剂具有以下能力：在悬浮液中保持至少两种不同尺寸和/或形状的纳米颗粒，并且将这些纳米颗粒递送到植物或植物部分的治疗区域中，而无需强力地保留纳米颗粒，从而降低了纳米颗粒的抗微生物特性。

抗微生物活性

图3示意性地示出了已经吸收了球形纳米颗粒304的微生物306，例如通过主动吸收或其它转运机制。纳米颗粒304可以自由地移动通过微生物306的内部，并与一种或多种重要的蛋白质或酶310接触，它们如果变性，将会杀死微生物。

纳米颗粒可以杀死或变性微生物的一种方法是通过催化重要蛋白质或酶中二硫(s-s)键的裂解。图4示意性地示出了具有二硫键的微生物蛋白质或酶410，所述二硫键被相邻的球形纳米颗粒404催化变性以产生变性蛋白质或酶412。在细菌或真菌的情况下，细胞内部可能发生重要蛋白质或酶的二硫键的裂解和/或重要蛋白质或酶的其它化学键的裂解，从而以这种方式杀死微生物。通过微生物的通常简单的蛋白质结构促进二硫(s-s)键的这种催化裂解，其中许多重要的二硫键暴露并且易于被催化裂解。

金属(例如银)纳米颗粒可以杀死微生物的另一机制是通过产生活性氧物质，例如过氧化物，其可以氧化裂解蛋白质键，包括但不限于酰胺键。

在病毒的情况下，作为选择，球形和珊瑚状金属纳米颗粒可以通过附着到糖蛋白上和/或催化蛋白质衣壳中的蛋白质变性反应来使病毒灭活，使得病毒不再能附着于宿主细胞和/或将遗传物质注入宿主细胞。因为非常小的纳米颗粒可以通过病毒，在病毒内部可能发生蛋白质衣壳的变性。使得不能附着于宿主细胞和/或将遗传物质注入宿主细胞的病毒基本上是无活性的并且不再致病。

尽管非离子金属纳米颗粒相对于微生物具有致死性，与其中大部分或全部重要二硫键被蛋白质的其他更稳定的区域屏蔽的简单微生物相比，它们对于含有复杂得多的蛋白质结构的人类、哺乳动物和健康的哺乳动物细胞而言可能相对无害。图5示意性地示出了具有二硫(s-s)键的哺乳动物蛋白质，所述二硫键被屏蔽以便抵抗被相邻的球形纳米颗粒催化变性。在许多情况下，非离子纳米颗粒不与人或哺乳动物细胞相互作用或不附着到人或哺乳动物细胞上，而保持在流体流动中并且跟随流体流动，不会越过屏障，保留在血管系统中，并且可以快速安全地通过尿液排出而不损害肾脏或其他细胞。

在银(ag)纳米颗粒的特定情况下，微生物中的银(ag)纳米颗粒的相互作用已经被证明是特别致命的，而不需要依赖于银离子(ag+)的产生来提供所需的抗微生物效果，如通常的常规胶体银组合物中的情况那样。银(ag)纳米颗粒提供有效的微生物控制而没有将有毒的银离子(ag+)显著释放到周围环境中的能力是本领域的实质进步。

微生物特异性纳米颗粒

可以选择颗粒的尺寸以靶向和杀死特定类型的微生物。例如，可以将纳米颗粒尺寸优化以选择性地靶向和杀死某些微生物。在治疗柑橘绿化病的情况下，纳米颗粒可以具有约1nm至约25nm，或约2nm至约15nm，或约2nm至约7nm，或约3nm至约6nm，或约7nm至约11nm，或约11nm至约14nm的粒度。

作为进一步示例，已经发现直径小于约9nm(例如1-7nm或3-6nm)的纳米颗粒对杀死病毒是有效的，已经发现直径约7nm至约12nm(例如8-10nm)的纳米颗粒对杀死细菌是有效的，并且已经发现直径为约12nm至约18nm(例如12-15nm)的纳米颗粒对杀真菌是有效的。在上述范围内，可能存在杀死特定类型的病毒、细菌或真菌最有效的纳米颗粒的特定尺寸。在一些实施方案中，用于治疗柑橘绿化病的组合物中包含有效杀死细菌的纳米颗粒(例如具有约7nm至约12nm或约8nm至约10nm的直径)。

在一些实施方案中，被设计成选择性地和优先地灭活细菌的球形纳米颗粒可具有约3nm至14nm，或约5nm至约13nm，或约7nm至约12nm，或约8nm至约10nm范围内的直径。在这些尺寸范围内，可以选择特定尺寸的“设计师抗细菌颗粒”，其针对特定细菌例如引起柑橘绿化病的细菌特别有效。

处理方法

在一些实施方案中，治疗植物疾病的方法包括：(1)将包含载体和金属纳米颗粒的纳米颗粒组合物施用于植物部分；和(2)纳米颗粒组合物杀死或变性植物或植物部分中的微生物。作为示例，植物疾病是柑橘绿化病，并且纳米颗粒组合物杀死导致柑橘绿化病的细菌。

在一些实施方案中，治疗植物疾病的方法包括：(1)去除患病植物部分；(2)通过将纳米颗粒组合物施用到患病植物部分上或其中来处理植物部分；和(3)将经处理的植物部分移植回植物上。作为示例，植物包括柑橘树且患病植物部分包含柑橘树分枝。有利地，金属纳米颗粒选择性地杀死引起柑橘绿化病或其它植物病的细菌，而不会伤害到可能接触经处理的柑橘树或者吃暴露于金属纳米颗粒的柑橘类果实的人。

另外或替代地，一些实施方案包括使用树干注入、微灌、叶喷洒和/或由木虱传播纳米颗粒中的一种或多种施用纳米颗粒，因为它们从经处理的植物(例如柑橘树)获得纳米颗粒并递送它们到其他植物的韧皮部。

实施例

实施例1-6

带柑橘绿化病的患病橙树进行如下处理。首先，去除患病分枝。第二，将分枝浸泡在由水和银(ag)纳米颗粒组成的纳米颗粒组合物中约12-24小时。第三，将纳米颗粒处理的分枝移植回到树上。将纳米颗粒组合物的有效性与氨苄青霉素进行有效性比较，因为已知氨苄西林杀死引起柑橘绿化的细菌。实施例1-6中使用的纳米颗粒组合物含有具有下表特征的银纳米颗粒。

所有的纳米颗粒组合物都有效杀死至少一些细菌。最有效的纳米颗粒组合物是实施例4的纳米颗粒组合物，其含有5ppm的粒度为3nm的银纳米颗粒，其与氨苄青霉素一样有效。此外，纳米颗粒组合物对人类和周围环境无毒，不留下痕量的离子纳米颗粒。据信，提供不容易形成金属离子的非离子金属纳米颗粒使得纳米颗粒基本上是惰性的，但是它们能够杀死引起植物疾病的微生物。

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其它具体形式实施。所描述的实施方案将在所有方面被认为仅仅是说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是前面的描述来表示。属于权利要求书的等同物的含义和范围内的所有变化将被包括在其范围内。