本发明涉及蛋鸡的养殖技术领域，具体涉及一种将氯化胆碱作为饲料添加剂用于养殖产蛋期蛋鸡的方法。
背景技术：
胆碱作为一种甲基供体和亲脂因子，其营养作用在上世纪三十年代提出，从上世纪40年代一直到80年代，国外学者陆续对胆碱预防蛋鸡软骨病和脂肪肝、影响产蛋率和蛋重以及其安全限量方面进行过研究，最近十年偶有添加氯化胆碱对鸡蛋卵磷脂沉积影响的研究。我国学者从上世纪九十年代开始从生产性能、脂肪肝、鸡蛋卵磷脂沉积等角度对胆碱的作用亦进行了评价。在分析比较各种科研文献的过程中，本申请发明人发现虽然添加胆碱在预防雏鸡软骨病和脂肪肝方面的作用得到了证实，并且尽管关于氯化胆碱在蛋鸡上使用效果的评价不少，但其效果如何一直缺乏统一的说法，对于其降低肝脏脂肪含量是否会带来其他方面的负面效应也并不清楚。有些研究表明，额外添加胆碱在提高蛋鸡生产性能方面有积极的作用，而有些研究研究表明，额外添加胆碱没有效果。在添加胆碱是否能引起鸡蛋卵磷脂含量升高方面仍然缺乏统一结论。众所周知，蛋鸡产蛋期可以到72周龄，甚至更长到79周龄。但由于蛋鸡试验成本高，研究试验的共同特点是试验期较短，有的甚至只有1个月，长者未超过3个月，而且所设添加量梯度少，不能说明问题。与此同时，通过分析比较，本申请发明人发现我国2004年鸡饲养标准和美国nrc(1994)中规定的蛋鸡对胆碱的需要量不一致，我国鸡饲养标准中提出蛋鸡产蛋期(19周开始)胆碱需要量为500mg/kg。而nrc(1994)中推荐褐壳蛋鸡胆碱需要量为1045mg/kg(采食量为110g时)。而且需要量的制定大多是基于有限数据，甚至是理论推导出来的。根据nrc(1994)中提出的玉米和豆粕中的胆碱含量分别为660mg/kg和2860mg/kg计算，按照nrc(1994)配制的产蛋期玉米豆粕型日粮，饲料本身胆碱含量可达到1045mg/kg，不需要额外添加胆碱。
在实际蛋鸡养殖过程中，氯化胆碱作为一种饲料添加剂，在蛋鸡饲料中的添加量为300-500mg/kg，有时高达1000mg/kg，甚至更高，而我国相关行业规定亦未对其添加量做明确规定。这样造成对蛋鸡饲料中是否添加胆碱，添加量多少缺乏统一客观的认识，加之，由于饲料原料的多样性和饲料配方的复杂性，饲料中胆碱背景值的差异，由此导致蛋鸡养殖户对添加胆碱的作用缺乏统一正确的观念，对胆碱添加或不添加都非常盲目，使用状况呈现两极化，有些养殖户纯粹为了节约成本，不添加氯化胆碱，而另一些养殖户则认为添加总比不添加好，在盲目添加氯化胆碱。造成胆碱的添加缺乏科学性指导，完全由养殖户的个人喜好和经营情况而定，如此不仅对养殖户的养殖效益造成不利影响，也难以使其养殖效益达到最大化。
纵观行业，目前缺乏一套完整的在蛋鸡饲料中添加氯化胆碱的指导方法。任何产品在问世后，经过实践应用经验，均需要后续的配套应用技术来补充和完善。上世纪末到本世纪初，饲料级氯化胆碱开始商品化使用。而蛋鸡在产蛋高峰前和高峰后生理特点差异很大，所以迫切需要针对某一饲料添加剂发明其应用技术，而仅仅依据不到3个月的短期试验数据是难以对其准确制定的，充其量只能做出定性的判断和是否有效的潜能判断。而蛋鸡养殖是微利的，获益与否依赖于整个生产期的饲养效果。另一方面，目前鸡蛋市场已经多元化，鸡蛋已经作为生产和提取卵磷脂的主要原料之一，提高鸡蛋中活性成分的含量也成为目前和未来蛋鸡产业重要的研究热点和探索目标。目前关于如何提高鸡蛋中卵磷脂含量的技术并不多见。饲料中添加氯化胆碱对鸡蛋中卵磷脂含量的影响方面的报道亦很少，而且有限的报道其结果还不一致。同时鉴于经济成本和养殖条件的限制，养殖户不具备系统比较添加与不添加氯化胆碱的利弊的可能。
鉴于上述诸多原因，迫切需要建立一套在蛋鸡，尤其是在蛋鸡的产蛋期，科学地添加氯化胆碱的养殖方法。
技术实现要素：
因此，针对现有技术的不足，为了在蛋鸡的产蛋期饲料中正确合理、有针对性地使用氯化胆碱，提高蛋鸡的生产性能，例如产蛋率、料蛋比、蛋重、产蛋量，改善所产鸡蛋的品质，例如鸡蛋的蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位、蛋壳厚度、蛋壳强度或者鸡蛋卵磷脂等，并且经济有效地利用氯化胆碱。
本发明提供了一种产蛋期蛋鸡的养殖方法，该方法包括：
1)向19-58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱500～16000mg/kg；
2)向等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱500～16000mg/kg；
其中，所述19-58周龄的蛋鸡喂食的饲料包括：玉米63.0wt％、豆粕25.4wt％、豆油0.5wt％、石粉8.5wt％、磷酸氢钙1.2wt％、食盐0.3wt％、dl-蛋氨酸0.1wt％、预混料1.0wt％；优选地所述19-58周龄的蛋鸡喂食的饲料中固有胆碱含量为450mg/kg～700mg/kg；
所述等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料包括：玉米66.1wt％、豆粕22.78wt％、石粉8.5wt％、磷酸氢钙1.2wt％、食盐0.35wt％、dl-蛋氨酸0.07wt％、预混料1.0wt％；优选地，所述等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中固有胆碱含量为450mg/kg～700mg/kg。
发明人通过研究发现，产蛋期蛋鸡饲料的氯化胆碱添加量对产蛋期蛋鸡的生产性能和所产鸡蛋的品质有着显著的影响。根据本发明的内容，养殖者可以根据对蛋鸡生产性能或者鸡蛋的品质的需求来调整氯化胆碱的添加量。由于在饲料中另行添加氯化胆碱会影响蛋鸡的生产性能，降低蛋鸡的产蛋率和产蛋量，并且提高鸡蛋的蛋黄总脂含量，因此，当所产鸡蛋用于食用用途时，不需要另行在产蛋期饲料中添加氯化胆碱，以降低养殖的成本，提高养殖效益，并且使鸡蛋的蛋黄总脂含量保持较低水平。
在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料和等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中分别添加氯化胆碱500～8000mg/kg，可以显著提高鸡蛋中卵磷脂含量和蛋黄重，可以实现鸡蛋中卵磷脂含量高和/或蛋黄重的特色养殖的需求。
在所述19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料和等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中分别添加氯化胆碱2000～4000mg/kg时，可以实现降低蛋鸡肝脏的脂肪含量，有效地防治鸡脂肪肝综合征。
在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加的氯化胆碱高于2000mg/kg时会对蛋鸡的产蛋量造成显著影响，而当氯化胆碱的添加量高于1000mg/kg时，会对蛋鸡的产蛋率造成显著影响，因此，可以选择在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱500～2000mg/kg，不仅可以实现提高鸡蛋中卵磷脂含量和蛋黄重的效果，还可以实现较低料蛋比、保持蛋鸡的产蛋量的效果；也可以进一步选择添加500～1000mg/kg氯化胆碱，在实现提高鸡蛋中卵磷脂含量和蛋黄重、较低料蛋比、保持蛋鸡的产蛋量的效果的同时，还可以保持蛋鸡的产蛋率，并且使鸡蛋的蛋白高度得到提高。
进一步地，还可以选择在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱500～1000mg/kg，在所述等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱500mg/kg，以进一步实现提高所产鸡蛋的蛋黄颜色。
根据本发明的另一方面，可以选择在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料和等于或大于59周龄的蛋鸡喂食的饲料中分别添加氯化胆碱1000～8000mg/kg以提高鸡蛋蛋黄中的总脂含量，尤其是提高蛋黄中卵磷脂的含量，从而满足在单个鸡蛋中提取到更多的卵磷脂需求；优先地，在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱4000～8000mg/kg。
更进一步地，在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱1000～2000mg/kg以保证蛋鸡的产蛋量；优选为在19～58周龄的蛋鸡喂食的饲料中添加氯化胆碱1000mg/kg优化蛋鸡所产鸡蛋的综合品质。
上述方法中19～58周的蛋鸡喂食的饲料和等于或大于59周的蛋鸡喂食的饲料中的预混料成分相当于折合成每千克日粮添加：维生素a8000iu、维生素d32200iu、维生素e20iu、维生素k2.0mg、硫胺素1.5mg、核黄素2.5mg、吡哆醇2.5mg、维生素b120.02mg、烟酸20mg、泛酸5.0mg、叶酸0.3mg、生物素0.1mg、锰80mg、锌65mg、铁60mg、铜8.0mg、碘0.8mg、硒0.3mg。
本发明的蛋鸡产蛋期的养殖方法具有但不限于以下有益效果：
1)本发明提供的蛋鸡产蛋期的养殖方法，通过控制产蛋期饲料中的氯化胆碱的添加量实现了对蛋鸡生产性能和所产鸡蛋的品质的按需调控，饲养者可以根据其需求，例如养殖目的(普通养殖和特色养殖)、产蛋分期(高峰前、高峰后)、销售方式(以个销售或以重量销售)，或者对鸡蛋品质的需求(蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位、蛋壳厚度、蛋壳强度或者鸡蛋卵磷脂等)，或者所产鸡蛋的用途(用于提取卵磷脂或用于直接食用等)、或者蛋鸡脂肪肝出血综合征预防等有目的的调整氯化胆碱的添加量，从而提高蛋鸡养殖的经济效益，保障鸡蛋品质和蛋鸡健康；
2)本发明提供了氯化胆碱在蛋鸡中的科学高效利用的技术方案，针对蛋鸡不同的生长阶段配合不同的基础饲料，不仅避免了背景胆碱值的剧烈波动，同时有益于规范、引导和提高饲料中添加氯化胆碱的应用效果，具有良好的实用价值和应用前景。
3)本发明提供的19～58周的蛋鸡喂食的饲料和等于或大于59周的蛋鸡喂食的饲料满足了产蛋期蛋鸡的各种基本营养需求，为蛋鸡的生产性能及其所产鸡蛋的品质提供了基础保障。
附图说明
图1是显示喂食了添加不同剂量的氯化胆碱的饲料组的鸡所产的鸡蛋中卵磷脂含量的变化趋势。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本文所使用的术语“料蛋比”，指的是产一公斤鸡蛋需多少公斤饲料；
本文所使用的术语“产蛋率”，指的是每天蛋数/母鸡数；
本文所使用的术语“固有胆碱”，指的是玉米和豆粕等饲料原料中含有的胆碱，并不包括另外添加到饲料中的氯化胆碱等；
本文所使用的术语“胆碱”，指的是化学意义上的胆碱，是卵磷脂的组成成分，分子式：c5h15no2，分子量：121.18，不同于氯化胆碱、磷脂酰胆碱等衍生化合物
本发明的实施例1中提供了为期6个月，分设6个氯化胆碱添加梯度(0、1000、2000、4000、8000、16000mg/kg)的蛋鸡饲养试验。分别从蛋鸡生产性能(产蛋率、料蛋比、蛋重、产蛋量)、鸡蛋常规品质(蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位、蛋壳厚度、蛋壳强度)和鸡蛋卵磷脂等方面进行了试验研究。
本发明在实施例1的基础上，进一步提供了实施例2，实施例2分设6个氯化胆碱添加梯度(0、500、1000、2000、4000、8000mg/kg)，分别从蛋鸡生产性能(产蛋率、料蛋比、蛋重、产蛋量)、鸡蛋常规品质(蛋黄颜色、蛋白高度、哈夫单位、蛋壳厚度、蛋壳强度)、蛋鸡肝脏(脂肪含量)、鸡蛋营养成分(总脂、甘油三酯、胆固醇、卵磷脂)等4个层面进行了为期1年的试验研究，以系统、全面地研究获取数据。
在上述研究的基础上，本发明根据饲养周期、养殖目的、销售途径、鸡蛋目标市场等方面分析了蛋鸡饲料中添加氯化胆碱的应用效果，并且进一步建立了一套在蛋鸡科学高效应用氯化胆碱的技术方案，提高蛋鸡养殖经济效益、保障鸡蛋品质和蛋鸡健康。
实施例1氯化胆碱在蛋鸡饲料中应用的试验效果研究(22周龄-46周龄，24周)
(一)研究方案
1.试验材料
氯化胆碱白色晶体，由国药集团化学试剂北京有限公司提供。纯度≥98.0％。
2.饲料配方
基础日粮参照nrc(1994)蛋鸡饲养标准配制。其它日粮按剂量在基础日粮中添加氯化胆碱。日粮组成和营养成分见表1。
表1日粮组成及营养水平
注：每千克预混料中含有：va149.5mg；vd334.5mg；ve287.5mg；vk311.5mg；vb192mg；vb2163.8mg；vb6172.5mg；vb120.4mg；泛酸钙287.5mg；烟酰胺805mg；叶酸46mg；生物素3.45mg；硫酸锰1741.1mg；锌680.5mg；铁418.8mg；铜151.2mg；钴4.5mg；碘10.7mg；硒2.7mg.
3.试验动物、分组及饲养管理
3.1试验动物与分组
选体重1600g左右的18周龄京红蛋鸡990只，预试验4周，22周龄时按单因素随机试验设计将试验鸡分成6组，对照组6个重复，试验组12个重复，每个重复15只鸡。1组为对照组，饲喂基础日粮；2-5组为试验组，日粮中分别添加0.10％(1000mg/kg)、0.20％(2000mg/kg)、0.40％(4000mg/kg)、0.80％(8000mg/kg)、1.60％(16000mg/kg)的氯化胆碱，保证各组营养水平基本一致，具体试验分组见表2。
表2试验鸡分组与处理
3.2饲养管理
试验鸡采用3层阶梯式笼养，由专人喂养，每天定时饲喂2次。自由采食、饮水，自然通风，采用14h光照(早6:00至晚8:00)，用干湿球温度计记录鸡舍内温度和湿度，保持鸡舍内温度在20～25℃，相对湿度在60％～70％，每天清粪一次。各组饲养管理条件完全相同。
4.试验日期
预试期1个月(此间饲料中不添加氯化胆碱)，正式试验期6个月。
5.测定指标与方法
5.1生产性能指标
每天15:30定时捡蛋一次，以重复为单位每日统计产蛋量(率)和蛋重。采用清扫料槽、称剩余料的方法，以重复为单位每周统计一次饲料消耗，试验结束时统计各阶段的产蛋率、平均蛋重、每日产蛋量和料蛋比。
5.2蛋品质指标
测定每枚蛋蛋重、蛋壳厚度、蛋壳强度、哈氏单位、蛋白高度、蛋黄颜色。具体采样方案见表3。
5.3全蛋液和蛋黄、蛋白液中磷脂酰胆碱含量的测定
测定了全蛋液和蛋黄、蛋白液中磷脂酰胆碱(卵磷脂的含量)，具体采样方案见表3。
表3采样方案
6.数据处理
采用sas软件进行统计分析和多重比较，结果以“平均数±标准差”表示。
(二)结果与分析
1.6种试验饲料中胆碱含量检测结果
表4饲料中胆碱含量的检测结果
2.添加不同剂量氯化胆碱对蛋鸡生产性能的影响
2.1对产蛋率的影响
如表5所示。从全期来看，产蛋率呈先升高后降低的趋势。在试验前期(1-5周)，5组(8000mg/kg)产蛋率明显低于1组(0对照组)和2组(1000mg/kg)(p<0.05)。到试验中期7、8、9周4组产蛋率显著低于2组；10-12周，4组(4000mg/kg)产蛋率显著低于1组和2组(p<0.05)，13-18周，2、3、4、5组产蛋率显著低于对照组(p<0.05)。试验后期，19-21周，6组产蛋率显著低于对照组(p<0.05)；22-24周，6组产蛋率显著低于对照组(p<0.05)。1-24周，3组、4组、5组、6组产蛋率显著低于对照组(p<0.05)，2组和对照组无显著差异；5组、6组显著低于2组(p<0.05)。表明添加氯化胆碱对产蛋率有不利影响，尤其是剂量达4000mg/kg以上对产蛋率有显著不利影响。
2.2对蛋重的影响
如表6所示。从全期来看，平均蛋重呈整体升高趋势。1～24周，6组(16000mg/kg)平均蛋重显著低于其它各组(p<0.05)，而其它各组间差异不显著(p>0.05)。1-24周，6组平均蛋重显著低于其他各组(p<0.05)。表明当添加量达到16000mg/kg时，氯化胆碱可显著降低每枚蛋的蛋重。
2.3对产蛋量的影响
如表7所示。对于每日产蛋重量，试验前期(1-5周)，对照组和2组(1000mg/kg)每日每个重复产蛋量显著高于5组(8000mg/kg)(p<0.05)；试验中期(7-12周)，2组每日产蛋量显著高于3组(2000mg/kg)、4组(4000mg/kg)和6组(16000mg/kg)(p<0.05)，其中6组每日产蛋量最低。试验后期，13-18周，2组、5组产蛋量显著低于对照组(p<0.05)。19-24周，5组、6组显著低于对照组。1-24周，3、4、5、6组显著低于对照组(p<0.05)。5，6组显著低于2组(p<0.05)。表明过量添加氯化胆碱对平均每日产蛋量有不利影响。添加剂量达到2000mg/kg以上，对产蛋量有显著不利影响。
2.4对采食量、料蛋比的影响
对采食量的影响如表8、表9所示。1-6周，各组之间采食量差异不显著(p>0.05)。7周时，4组(4000mg/kg)和6组(16000mg/kg)采食量显著低于2组(1000mg/kg)(p<0.05)。8周时，6组采食量显著低于2组(p<0.05)。10-12周时，4组采食量显著低于对照组(p<0.05)，6组采食量显著高于2组和4组(p<0.05)。试验后期，13-15周，2、3、4和5组采食量显著低于对照组(p<0.05)；16-18周，4组采食量显著高于对照组、5组以及6组(p<0.05)。19-21周，6组采食量显著低于对照组(p<0.05)，22-24周，5和6组采食量显著低于对照组(p<0.05)。1～24周，组间采食量没有显著差异。
对于料蛋比的影响如表9所示。4、6、7周，2组(1000mg/kg)料蛋比显著高于对照组(p<0.05)，10-12周间，4组料蛋比显著低于1、3组(p<0.05)。13～15周，2、3、4、5组料蛋比显著低于对照组和6组(p<0.05)。试验后期，22-24周时，6组料蛋比显著低于对照组(p<0.05)。1-24周，各组料蛋比没有显著差异。
表5氯化胆碱对蛋鸡产蛋率的影响(％)
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(p>0.05)，下同。
表6氯化胆碱对平均每枚蛋重的影响
表7氯化胆碱对每个重复每日产蛋量的影响(％)
表8氯化胆碱对蛋鸡采食量的影响
表9氯化胆碱对料蛋比的影响
3.添加不同剂量氯化胆碱对鸡蛋品质的影响
3.1对蛋壳厚度的影响
如表10所示，随着试验的进行，蛋壳厚度先增高后降低。具体从各阶段来看，试验前期，试验第2周各试验组蛋壳厚度均显著高于对照组(p<0.05)，试验第3周2,4,6组蛋壳厚度显著高于对照组(p<0.05)，试验第4周3,4,5，6组蛋壳厚度显著高于对照组(p<0.05)，4组和5组显著高于2组(p<0.05)，第5周时5组和6组蛋壳厚度显著低于3组(p<0.05),第6周时2,3,4和5组蛋壳厚度显著高于1组(p<0.05),5组显著低于3组(p<0.05)，第7周时2组和4组蛋壳厚度显著高于对照组(p<0.05),5组和6组显著低于2组(p<0.05)。试验中期，第9周时5组蛋壳厚度显著高于4组(p<0.05)，第12周时各组间蛋壳厚度没有显著差异。试验后期，第20周时，各组间蛋壳厚度没有显著差异。表明在产蛋前期添加氯化胆碱可以增加蛋壳厚度，添加1000mg/kg即可。
3.2对蛋壳强度的影响
如表11所示，蛋壳强度从全期来看呈不断下降趋势。试验前期，第1周5组和6组蛋壳强度显著低于4组(p<0.05)，第2周4组蛋壳强度显著高于对照组(p<0.05)，第4周5组蛋壳强度显著低于1，2，3，4组(p<0.05)，第7周2，4，5组蛋壳强度显著高于对照组(p<0.05)。试验中期，第12周2组和4组蛋壳强度显著低于对照组(p<0.05)。试验后期，20周时，4组，6组蛋壳强度显著低于对照组(p<0.05)。
3.3对蛋白高度的影响
如表12所示，蛋白高度呈先增高后降低的趋势。试验前期，第5周2组蛋白高度显著高于1组，第8周6组蛋白高度显著低于1组和2组。试验中期，第9周4和6组蛋白高度显著低于2组，第12周2，3，4，5和6组蛋白高度显著高于1组。试验后期，20周时各组蛋白高度没有显著差异。表明试验前期添加氯化胆碱可降低蛋白高度，试验后期可提高蛋白高度。
3.4对哈夫单位的影响
如表13所示，哈夫单位均呈先增高后降低的趋势。试验前期，第2周时6组哈夫单位显著高于3组(p<0.05)，4周时5组和6组显著高于对照组(p<0.05)，8周时对照组和2组显著高于6组。试验中期，12周时，2组，3组和6组显著高于对照组。试验后期，20周时各组哈氏单位i没有显著差异。
3.5对蛋黄颜色的影响
如表14所示，试验前期，2，3，4，5，6周其他各组蛋黄颜色显著高于对照组(p<0.05)；第7周4组和6组显著低于3组，第8周2，4，5，6组显著低于对照组。试验中期，第9周其他各组蛋黄颜色显著低于对照组，第12周4组显著低于对照组，6组显著高于对照组。试验后期，20周时2组，3组，4组蛋黄颜色显著高于对照组。
表10氯化胆碱对蛋壳厚度的影响
表11氯化胆碱对蛋壳强度的影响
表12氯化胆碱对蛋白高度的影响
表13氯化胆碱对鸡蛋哈氏单位的影响
表14氯化胆碱对蛋黄颜色的影响
4.添加不同剂量氯化胆碱对鸡蛋磷脂酰胆碱(卵磷脂)含量的影响
4.1对全蛋中磷脂酰胆碱(卵磷脂)含量的影响
如表15所示，随着日龄的增加，鸡蛋中卵磷脂含量呈逐渐升高的趋势，且随着饲料中添加氯化胆碱含量的增加，鸡蛋中卵磷脂含量增加。
表15氯化胆碱对全蛋中磷脂酰胆碱含量的影响
注：表中上标*表示与对照组相比，差异显著(p<0.05)。上标**表示与对照组相比，差异极显著(p<0.01)。
4.2对蛋黄、蛋白磷脂酰胆碱(卵磷脂)含量的影响
如表16所示，在添加氯化胆碱20周后，添加16000mg/kg氯化胆碱组蛋黄中卵磷脂含量极显著高于未添加组(p<0.01)，比未添加组升高26.5％；添加1000mg/kg氯化胆碱和未添加组没有显著差异。所有各组蛋白中均未检出卵磷脂。
表16氯化胆碱对蛋黄、蛋白中磷脂酰胆碱(卵磷脂)含量的影响
注：表中上标**表示与对照组相比，差异极显著(p<0.01)。
三、结论
通过综合分析生产性能和蛋品质数据，得出如下结论：
3.1饲料中添加氯化胆碱高于1000mg/kg即对蛋鸡生产性能有不利影响。其中，添加剂量达1000mg/kg时即对产蛋率有不利影响，尤其是达4000mg/kg时对产蛋率有显著不利影响；添加剂量达2000mg/kg时对产蛋量有显著不利影响；添加剂量达16000mg/kg时可显著降低每枚蛋的蛋重。
3.2过量氯化胆碱可以增加蛋壳厚度,4000mg/kg效果最好，大于8000mg/kg反而会降低蛋壳厚度。添加氯化胆碱(1000mg/kg)可提高蛋白高度，过量添加氯化胆碱可降低蛋白高度。
3.3添加氯化胆碱可提高鸡蛋中卵磷脂含量，添加量与卵磷脂含量呈线性正相关。添加16000mg/kg氯化胆碱，鸡蛋卵磷脂含量比未添加组提高26.5％。
3.4蛋鸡饲料中添加氯化胆碱2000mg/kg时既不影响蛋鸡的产蛋量，又可以有效地降低蛋鸡所产鸡蛋的蛋重，并且添加氯化胆碱的量为0～1000mg/kg时不影响蛋鸡的产蛋率。
本发明的发明人进一步设计以如实施例2所示的实验以评价1000mg/kg以下剂量的有效性和安全性。
实施例2氯化胆碱在蛋鸡饲料中应用的试验效果研究(19周龄-68周龄，49周)
(一)材料与方法
1.试验设计
选取540只19周龄体重相近健康海兰褐蛋鸡随机分为6组，氯化胆碱添加水平分别为0(对照组)、500、1000、2000、4000和8000mg/kg。每组设6个重复，每个重复15只鸡。饲养周期分2阶段：试验第一阶段(19～58周龄)，试验第二阶段(59～68周龄)。
2.试验日粮
试验基础日粮参考nrc(1994)配制，日粮组成及营养成分见表18和19。氯化胆碱(ar，纯度≥98.0％)由国药集团化学试剂有限公司生产。
3.饲养管理
饲养试验在动物营养国家重点实验室昌平基地代谢室进行，采用3层梯形式笼养，每笼(长×宽×高：40cm×38cm×38cm)3只鸡，相邻的5个笼为一个重复。每天定时喂料2次(2×60g)，自由采食和饮水。采用光照程序控制器控制光照，试验开始时每天光照14h，以后每周增加光照时间30min直到16h(6：00至22：00)，试验期鸡舍温度保持22±3℃，相对湿度45％～65％。
4.样品采集及指标测定
4.1饲料固有胆碱含量测定
试验饲料配制前，采集饲料原料玉米和豆粕，测定其固有胆碱含量。饲料每4周配一次，各试验组取样250g于-20℃保存待测。采用离子色谱法(ics-2500，美国dionex公司)测定饲料中固有胆碱含量。饲料样通过0.42mm孔筛，准确称取2g(精确至0.0001g)样品于50ml离心管中，加入25ml超纯水高速漩涡1min，70℃超声波萃取30min，萃取过程中摇晃混匀3次。随后在往复振荡器上振荡10min。室温3000g离心10min后转入到50ml离心管中，重复上述操作，超纯水定容至50ml，摇匀。取0.5ml滤液，加4.5ml超纯水过0.45μm滤膜，上机测定。
4.2生产性能
试验期间，每天以重复为单位记录产蛋数、蛋重以及死淘数，根据死淘数调整每天加料量；每周末进行结料，并记录耗料量，计算20～58周龄、59～68周龄的采食量、产蛋率、蛋重、料蛋比以及产蛋量。
4.3蛋品质
试验期间，每4周末以重复为单位采集所有鸡蛋12h内进行蛋品质测定。1)蛋壳强度测定：蛋壳强度测试仪(model-iii,robotmationco.ltd.,tokyo,japan)；2)蛋壳厚度测定：蛋壳厚度检测器(modelp-1,ozakimfg.co.ltd.,tokyo,japan)；3)蛋白高度、哈氏单位及蛋黄颜色测定：蛋品质分析仪(emt-5200,robotmationco.ltd.,tokyo,japan)。
58和68周末，绝食12h后每重复分别随机选取4、6只鸡称重屠宰，屠宰前选取1只鸡，分别使用抗凝与不抗凝的一次性真空采血管采取颈静脉血样各5ml。血液室温放置30min，3000转/min离心10min，血清、血浆样分装于-70℃保存。鸡只屠宰前称重，开膛，迅速取整个肝脏称重，取部分左侧肝样于-70℃保存待测。26、38、58和68周末，以重复为单位收集当天所有鸡蛋，分离蛋黄和蛋清并称重，采集蛋黄样于-20℃保存待测。
4.4肝脏、蛋黄总脂含量测定
肝脏和蛋黄总脂测定方法参照folch等(1957)和trampel等(2005)。测定步骤：称取样品2g于50ml离心管中，加入50μl丁基羟基甲苯(7.2％溶与乙醇)和30mlfolchⅰ溶液(氯仿：甲醇＝2:1，v/v)冰浴下高速匀浆30s(ultra-turraxt10，ikaworksinc，usa)。盖上离心管，室温静置12h后过滤到100ml量筒中，滤纸用10mlfolchⅰ溶液冲洗两次。量筒中加入8ml的0.88％的nacl溶液，小心摇匀。然后用5mlfolchⅱ溶液(氯仿：甲醇：水＝3:47:48，v/v/v)冲洗量筒内壁两次。静置5h后记录脂层体积，小心移除上层溶液(甲醇和水)，吸取20ml脂层于玻璃闪烁瓶中，液氮流下50℃干燥5h，恒重。脂质含量(％)＝脂质重量(g)/肝脏重(g)×100。
4.5肝脏、蛋黄甘油三酯(tg)含量测定
肝脏甘油三酯测定参照slama(2007)，称取1g肝脏，加入12mlfolchⅰ溶液冰浴条件下高速匀浆30s，室温抽提5h，过滤，folchⅰ溶液定容至50ml。根据甘油三酯测定试剂盒进行测定(中生北控生物科技股份有限公司，北京)。蛋黄甘油三酯测定前处理参照(elkin和rogler，1990)，1g蛋黄样品加入15mlfolchⅰ溶液，冰浴下匀浆30s，盖上盖子，摇匀。静置30min后重新摇晃混匀，超声波萃取后过滤，静置分层。根据甘油三酯测定试剂盒进行测定(中生北控生物科技股份有限公司，北京)。
4.6蛋黄总胆固醇(tc)、卵磷脂(pc)含量测定
蛋黄总胆固醇含量参照pasin等(1998)采用酶比色法测定。称取3g蛋黄液，加入27ml2％(w/v，0.32m)的nacl溶液，在室温下摇床震荡2h(盖上盖子，防止挥发)。然后取上述混合液1ml，加入9ml2％(w/v)的nacl溶液制备成待测样，采用总胆固醇试剂盒测定(中生北控生物科技股份有限公司，北京)。测定样包括0.1ml的2％(w/v)nacl溶液，1ml的工作液，0.01ml的待测混合液。
蛋黄卵磷脂测定参照陈艳辉(2011)，采用分光光度法测定。取5g蛋黄液于50ml离心管中，加入90ml(3×30ml)95％的乙醇，冰浴条件下匀浆，40℃超声波10min，3000转/min离心10min，将上清液溶液转移到容量瓶，用无水乙醇定容至100ml。取10ml蛋黄乙醇溶液于消化管中蒸干乙醇。消化管冷却后，加入3ml硫酸和3ml高氯酸－硝酸混合液，置于电炉上消化。待溶液变为无色液体时，即消化完全。溶液冷却后，向消化管中加入20ml的超纯水，转移到100ml容量瓶中，用超纯水多次洗涤消化管并转入到容量瓶中，定容，待测。
4.7血清总胆固醇、甘油三酯含量测定
血清总胆固醇、甘油三酯含量测定分别采用总胆固醇测定试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，北京)和甘油三酯测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，北京)。测定方法(gpo-pap法)按试剂盒说明书进行。
4.8肝脏病理学检测
取各试验组蛋鸡肝脏，于10％中性福尔马林溶液中预固定24h，组织修整后重新固定于10％中性福尔马林溶液中。常规法石蜡包埋，5μm连续切片，h..e.染色，自然晾干后光镜下观察并拍照。
5.数据处理及统计分析
数据采用sas统计软件glm模型进行anova分析，组间差异以duncan法进行多重比较(duncan，1955)；利用正交多项式进行趋势分析(kuehl，1994)。产蛋率经反正弦转换后进行统计分析，以p<0.05为显著水平。
表1719-58周龄试验日粮组成及营养水平
每千克日粮添加：va8000iu，vd32200iu，ve20iu，vk2mg，硫胺素1.5mg，核黄素2.5mg，吡哆醇2.5mg，vb120.02mg，烟酸20mg，泛酸5mg，叶酸0.3mg，生物素0.1mg，锰80mg，锌65mg，铁60mg，铜8mg，碘0.8mg，硒0.3mg。
表1859-68周龄试验日粮组成及营养水平
每千克日粮添加：va8000iu，vd32200iu，ve20iu，vk2mg，硫胺素1.5mg，核黄素2.5mg，吡哆醇2.5mg，vb120.02mg，烟酸20mg，泛酸5mg，叶酸0.3mg，生物素0.1mg，锰80mg，锌65mg，铁60mg，铜8mg，碘0.8mg，硒0.3mg。
(二)试验结果
1.饲料胆碱含量
如表17和18所示，基础日粮中固有胆碱含量分别为700和653mg/kg；由表19可见，玉米和豆粕中固有胆碱含量分别为324和2045mg/kg。
表19玉米、豆粕中固有胆碱含量(mg/kg)
2.氯化胆碱对蛋鸡生产性能的影响
试验记录和统计了各处理20～58周龄和59～68周龄的生产性能，见表20。20～58周龄和59～68周龄蛋鸡平均采食量分别为113.6和116.6g。各处理组间采食量无显著差异(p>0.05)。氯化胆碱对蛋鸡产蛋率、蛋重、产蛋量和料蛋比均无显著影响，但20～58周龄蛋鸡产蛋率随胆碱含量增加呈线性降低(p<0.05)，蛋重随饲料中胆碱含量增加呈二次曲线增加趋势(p＝0.052)。添加8000mg/kg氯化胆碱组产蛋率和产蛋量最低，料蛋比最高。
3.氯化胆碱对蛋鸡体重和死淘率的影响
如表21所示，与对照组相比，添加2000、4000和8000mg/kg的氯化胆碱显著降低(p<0.05)58周龄的蛋鸡体重与体增重。并且58周龄蛋鸡体重与体增重随氯化胆碱添加量增加呈线性、二次曲线降低(p<0.01和p<0.05)。补充氯化胆碱对68周龄的蛋鸡体重无显著影响(p>0.05)，但显著增加59～68周龄蛋鸡体增重(p<0.01)。整个试验期，蛋鸡死淘率无显著差异(p>0.05)，20～58周龄和59～68周龄蛋鸡死淘率分别为3.34％和2.07％。
4.氯化胆碱对蛋品质的影响
氯化胆碱对蛋品质的影响如表22所示。58周龄蛋鸡蛋黄重与氯化胆碱添加量呈二次曲线增加(p<0.05)。68周龄，添加氯化胆碱组蛋黄重均高于对照组，但数据统计上无显著差异。59～68周龄蛋鸡蛋白高度和哈氏单位随氯化胆碱添加量增加呈线性升高(p<0.01和p<0.05)。与对照组相比，添加500和1000mg/kg的氯化胆碱显著提高(p<0.01)20～58周龄蛋鸡蛋黄颜色。整个试验期，添加氯化胆碱对蛋壳厚度和蛋壳强度无显著影响(p>0.05)
表20氯化胆碱对蛋鸡生产性能的影响
同一行肩标不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同
表21氯化胆碱对蛋鸡体重和死亡率的影响
表22氯化胆碱对蛋品质的影响
5.氯化胆碱对蛋鸡肝脏重、肝脏总脂及甘油三酯(tg)的影响
氯化胆碱对蛋鸡相对肝重、肝脏总脂及tg的影响如表23所示。日粮中添加氯化胆碱对58和68周龄蛋鸡相对肝重无影响。添加氯化胆碱降低蛋鸡肝脏脂肪含量，其中，添加2000和4000mg/kg氯化胆碱显著降低肝脏脂肪含量(p<0.05)。添加2000mg/kg氯化胆碱组蛋鸡肝脏脂肪含量最低，与对照组相比，58和68周龄肝脏脂肪含量分别降低了9.69％和9.90％。添加氯化胆碱降低肝脏甘油三酯含量，其中，添加2000和4000mg/kg氯化胆碱显著降低肝脏甘油三酯含量(p<0.05和p<0.001)。58和68周龄，添加2000和4000mg/kg氯化胆碱组肝脏甘油三酯含量最低，与对照组相比分别下降了36.01％和38.48％。
表23.氯化胆碱对产蛋鸡相对肝脏重、肝脏总脂及甘油三酯含量的影响
6.氯化胆碱对蛋鸡血清总胆固醇、甘油三酯含量的影响
胆碱对蛋鸡血清总胆固醇和甘油三酯含量的影响如表24所示，日粮中添加氯化胆碱对58和68周龄蛋鸡血清中总胆固醇和甘油三酯含量无显著影响(p>0.05)。
表24氯化胆碱对产蛋鸡血清总胆固醇和甘油三酯含量的影响
7.氯化胆碱对蛋黄总脂、甘油三酯含量的影响
胆碱对蛋黄总脂和tg的影响如表25所示，日粮中添加氯化胆碱增加蛋黄总脂含量。58和68周龄对照组蛋鸡蛋黄总脂含量(mg/g)分别为330和322。添加1000～8000mg/kg氯化胆碱显著增加58和68周龄蛋鸡蛋黄中总脂含量(mg/g)；添加4000和8000mg/kg氯化胆碱显著增加(p＝0.001)58周龄蛋鸡蛋黄中总脂含量(mg/蛋黄)。其中，添加4000mg/kg氯化胆碱组蛋黄总脂含量最高，分别为341和330(mg/g)。添加氯化胆碱提高58和68周龄蛋鸡蛋黄中甘油三酯含量(mg/g)，但差异不显著(p>0.05)。58周龄，添加1000～4000mg/kg氯化胆碱显著增加(p<0.05)蛋黄甘油三酯含量(mg/蛋黄)；68周龄，添加氯化胆碱组蛋黄甘油三酯含量(mg/蛋黄)均高于对照组，但差异不显著(p>0.05)。
表25氯化胆碱对蛋黄总脂、甘油三酯含量的影响
8.氯化胆碱对蛋黄总胆固醇和卵磷脂含量的影响
氯化胆碱对蛋黄总胆固醇和卵磷脂的影响如表26所示，26、38、58和68周龄对照组蛋鸡蛋黄中总胆固醇含量(mg/g)分别为11.80、12.54、12.75和12.48，添加氯化胆碱对蛋黄总胆固醇含量无显著影响(p>0.05)。26周龄时，添加氯化胆碱(500～8000mg/kg)显著增加蛋黄卵磷脂含量(p<0.001)；添加1000～8000mg/kg氯化胆碱显著增加38、58和68周龄蛋鸡蛋黄卵磷脂含量(p<0.001和p<0.05)。
表26氯化胆碱对蛋黄总胆固醇和卵磷脂含量的影响
三、结论
1.本试验所用未添加氯化胆碱的玉米豆粕型饲料，固有胆碱含量达700mg/kg，能满足蛋鸡对胆碱的需要。
2.玉米豆粕型日粮中，添加500～1000mg/kg的氯化胆碱增加开产和产蛋高峰期(19-58周龄)蛋黄颜色；添加氯化胆碱提高产蛋后期(59-68周龄)蛋白高度和哈氏单位。
3.日粮中添加2000～4000mg/kg氯化胆碱降低蛋鸡肝脏脂肪和甘油三酯含量，添加2000氯化胆碱组肝脏脂肪含量最低。
4.日粮中添加氯化胆碱提高蛋鸡蛋黄总脂含量，其中，添加4000mg/kg氯化胆碱组鸡蛋的蛋黄总脂含量最高。添加氯化胆碱对蛋黄总胆固醇无影响，增加蛋黄甘油三酯和卵磷脂含量。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。