本发明涉及青鱼的三倍体繁育方法，具体涉及一种提高青鱼三倍体育成率的方法。
背景技术：
青鱼是中国淡水养殖的四大家鱼之一。三倍体青鱼的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，不育三倍体青鱼是通过四倍体鱼与二倍体鱼倍间杂交获得，但要获得98%以上的三倍体鱼，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。
在鱼类遗传育种中，通常利用冷/热休克，或通过杂交等方法抑制受精卵的第一次有丝分裂或直接异源染色体加倍，制备出同源或异源四倍体鱼，其中冷休克一般是与静水压处理一起，难以获得较高纯度的四倍体系，而热休克的方式虽然易于操作，同样，难以获得纯度高的四倍体系；而杂交的方法虽然纯度高，但成功率低、周期长。此外，上述这些方法制备的四倍体鱼，有些可育、有些又不可育，同时也可能存在基因混杂现象（异源四倍体），容易造成生物危险。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定的提高青鱼三倍体育成率的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种提高青鱼三倍体育成率的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为60～90mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240～400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液待用；催产剂溶液是由脑垂体经过0.9%生理盐水稀释配制，催产剂溶液中脑垂体的剂量为0.1-0.2mg/g；
（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为40～160μg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注射液40-160μg；
（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1～1.0℃的冷水中，静水压压力为250～340Kg/cm2，持续时间为3～5min；
（5）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60～180mg/l，睾酮的浓度为10～50mg/l；
（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得青鱼雄性四倍体纯系；
（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%的三倍体青鱼系。
本发明的优点：1、本发明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重作用的同时，将受精卵第一次卵裂时间推延3-5min，并提高了所有受精卵第一次卵裂的同步度（可达99%），为染色体加倍和提高其四倍体率提供了时间保障和奠定了坚实的基础；2、在受精卵一次卵裂采用冷休克与较低的静水压（低于常用的350kg/cm2），以及较短的处理时间（低于5min），不仅有效降低了因冷休克时间过长、压力过高对受精卵的破坏程度，提高受精卵的成活率，而且降低了操作难度和加压成本；3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证雄性转化率；4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的青鱼三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要的是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
实施例一
提高青鱼三倍体育成率的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为90mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到240ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的浓度约为0.375mg/ml，待用；
（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为80μg/kg；
（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为0℃的冷水中，静水压压力为280Kg/cm2，持续时间为5min；
（5）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为60mg/l，睾酮的浓度为10mg/l；
（6）雄性四倍体纯系的获得：取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得青鱼雄性四倍体纯系；
（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
实施例二
提高青鱼三倍体育成率的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬抑制剂配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入90%的乙醇溶液进行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量约为60mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催产剂溶液中，其比例为1ml他莫昔芬母液加入到400ml的已配制好的催产剂溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的浓度为0.15mg/ml，待用；
（3）注射处理母本：在母本人工产卵前，按常规人工催产方法对母本进行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量约为160μg/kg；
（4）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把经过注射处理的母本与不经过任何处理的父本杂交获得的受精卵放入温度为-1℃的冷水中，静水压压力为280Kg/cm2，持续时间为3min；
（5）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为180mg/l，睾酮的浓度为50mg/l；
（6）取步骤（4）处理后的受精卵放入按步骤（5）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10s，然后取出放于孵化器中正常孵化；从而获得100%青鱼雄性四倍体纯系；
（7）三倍体的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式及结果统计。
附：青鱼三倍体育成结果统计
注：上述结果是在注射液中他莫昔芬的浓度为0.15mg/ml的条件下常温浸泡10S，静水压处理3分钟所取得的结果。