本发明涉及蛙的多倍体繁育方法，具体涉及蛙三倍体纯系高效育成方法。
背景技术：
蛙，常见的有虎纹蛙、棘胸蛙等，无尾，善于跳跃，属于两栖动物的蛙科。三倍体蛙的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，要获得三倍体不育蛙，最快捷有效的方法是通过四倍体与二倍体倍间杂交获得，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体鱼系。目前为止尚未发现关于蛙雄性四倍体高效育成的报道，更未见用全雄四倍体与二倍体母本回交的先例。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高达100%的蛙三倍体纯系高效育成方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
蛙三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为25～30g/kg喂养料，待用；
（2）投喂：在母蛙产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蛙投喂10～20g，下午6：00每100g母蛙投喂10～15g；至其卵发育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；
（3）热休克处理：在第一次卵裂前3～5min，把步骤（2）的受精卵放入水温为39～42℃、溶氧达5-8mg/l以上的水体中，保持3～5min；然后取出，放入常规孵化水槽中待用；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80～140mg/l，睾酮的浓度为20～80mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗成蝌蚪；
（6）取步骤（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10～15g氯米芬，投喂量为每1000只投喂10～20g加有氯米芬的幼体料，直至变为幼蛙；从而获得雄性蛙四倍体纯系。
（7）取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
本发明的优点：1、本发明中在母本中投喂他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min）、提高了所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可达99%），为操作下一步提供时间保障和奠定了染色体加倍的基础；2、在受精卵一次卵裂采用较短的热休克处理时间，有效减少长时间热休克对受精卵的破坏作用，提高受精卵的成活率；3、雌激素抑制剂溶液浸泡，进一步强化了雄性转化率；4、蝌蚪继续投喂氯米芬，再次强化与保证雄性的转化率；5、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
实施例一
虎纹蛙三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为30g/kg喂养料，待用；
（2）投喂：在母蛙产卵前5天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蛙投喂20g，下午6：00每100g母蛙投喂15g；至其卵发育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；
（3）热休克处理：第一次卵裂前3min，把步骤（2）的受精卵放入水温为40℃、溶氧达5mg/l以上的水体中，保持5min；然后取出，放入常规孵化水槽中待用；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80mg/l，睾酮的浓度为20mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；
（6）取步骤（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加15g氯米芬，投喂量为每1000只20g幼体料，直至变为幼蛙；从而获得雄性蛙四倍体纯系。
（7）取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
实施例二
棘胸蛙三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到蛙人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为25g/kg喂养料，待用；
（2）投喂：在母蛙产卵前10天，按常规饲料投喂方法对母蛙进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蛙投喂20g，下午6：00每100g母蛙投喂15g；至其卵发育成熟，然后，取雄蛙放在一起，使其自然产卵交配受精，得受精卵，备用；
（3）热休克处理：处理后产的受精卵在第一次卵裂前5min，放入水温为42℃、溶氧达8mg/l以上的水体中，保持3min；然后取出，放入常规孵化水槽中待用；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为120mg/l，睾酮的浓度为60mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡15s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至出苗；
（6）取步骤（5）中的蝌蚪，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10g氯米芬，投喂量为每1000只10g幼体料，直至变为幼蛙；从而获得雄性蛙四倍体纯系。
（7）取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式及结果统计。
附：蛙三倍体育成结果统计
注：上述结果是在母蛙产卵前10天投喂他莫昔芬，一次卵裂前5min热休克保持3min所取得的结果，雌激素抑制剂常温浸泡15s，每万尾投喂氯米芬0.1g所取得的结果。