一种优化的抗氧化脱细胞保护液的制作方法

本发明属于化学组合物技术领域，具体为一种优化的抗氧化脱细胞保护液及其制备方法和应用。

背景技术：

21世纪是生物科学全新发展日新月异的世纪，作为过去10年生物医学领域冉冉升起的一颗朝阳——TERM(Tissue engineering & Regenerative Medicine组织工程及再生医学)备受世界瞩目。在TERM的研究和应用中，相关脱细胞的技术占据了举足轻重的地位。脱细胞是指生物医学工程领域将细胞外间充质与细胞分离的过程，分离所得的细胞外间充质支架可用于人造器官和组织再生。采用物理、化学、酶处理及三者的混合方法是目前世界范围内所普遍使用的脱细胞方法，其目的都是为保证脱细胞组织的细胞机构的完整性和生物特性不受破坏，使之成为免疫原性低，具备良好生物相容性的理想生物材料。但脱细胞采用的方法往往耗时长，条件剧烈，在脱细胞过程中难免对所脱细胞组织造成较大破坏。因此开发一种保护措施(如保护液)保护好相关组织在脱细胞过程中的组织结构完整性将填补这方面的空白。

目前临床上的组织移植修复多应用人工合成的高分子材料，往往存在自我降解性能低下，组织相容性差的问题，生物工程材料如脱细胞眼结膜、血管和肌腱/韧带等在临床应用方面非常迫切。因此取得组织结构完整、生物特性不受破坏的生物工程材料对于临床的应用亦具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种优化的抗氧化脱细胞保护液的制备方法和应用。

本发明所述的组织保护液其成分为：

1、DMEM细胞培养基粉末5-10g/L，配制成维持细胞营养成分的母液；

2、L-组氨酸盐酸盐2.87-3.83g/L，使晶体渗透压维持在330-380mOsm/kgH2O之间；

3、硫酸软骨素25-30g/L，羟丙基甲基纤维素2-8g/L，低分子右旋糖酐20-35g/L，来维持其液体的胶体渗透压为310-350mOsm/kg H₂O之间。由于硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和低分子右旋糖苷的协同作用，可以减少保护液中的负电荷，同时保持一定的胶体渗透压，使脱细胞过程中，所脱细胞组织的内外压平衡；

4、别嘌呤醇0.5-0.8g/L，能够减少脱细胞组织在缺氧状态时的抗氧化功能；

5、HEPES缓冲液20-25ml/L，用以调节pH值为7.2-8.0；

6、盐酸地塞米松1-2mg/L，还原型谷胱苷肽1.5-3g/L，以稳定脱细胞组织的溶酶体膜及生物膜，增强细胞对内毒素的抵御能力，更好地保持组织细胞的形态和功能；

7、左氧氟沙星0.1-0.2g/L，作为新一代的氟喹诺酮，可以同时杀灭供体携带的革蓝氏阳性和阴性的病原菌。

本发明所述的脱细胞组织保护液为淡红色液体。

附图说明

图1全程添加保存保护液的脱细胞眼结膜切片DAPI染色

图2全程添加灭菌注射用水的脱细胞眼结膜切片DAPI染色

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，这些实施例只用于进一步详述说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定，在本发明保护范围之内做出非本质的调整需本发明方授权。

本发明的实施例1

抗氧化脱细胞保护液的制备：

1、取DMEM粉末10g加入去离子水500ml，溶解后高压灭菌；

2、取硫酸软骨素25g加入去离子水275ml加热溶解高压灭菌，制成硫酸软骨素溶液；低分子右旋糖苷20g加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成低分子右旋糖苷溶液；L-组氨酸盐酸盐2.87g，加入注射用水100ml溶解高压灭菌，制成L-组氨酸盐酸盐溶液；

3、取无菌容器加入DMEM培养液500ml，高压灭菌硫酸软骨素275ml，低分子右旋糖酐溶液100ml，L-组氨酸盐酸盐溶液100ml；加入别嘌呤醇0.5g，羟丙基甲基纤维素5g，还原型谷胱苷肽2g，地塞米松注射液2mg，左氧氟沙星注射液0.1g混匀；

4、Hepes缓冲液调节PH值至7.4；

5、调节晶体渗透压为340mOsm/kgH₂O；

6、调节胶体渗透压为350mOsm/kgH₂O。

本发明的实施例2

使用脱细胞保护液对猪肌腱组织脱细胞的效果及组织结构观察及检测

新鲜猪宰后3小时内取出肌腱组织，无菌处理，将肌腱腱膜切开做出1cm×2cm的组织片，取5片密封在盛有10ml实施例1所配保存液的塑料袋中；另对照组为5枚组织片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于600MP高静压条件下，处理8次，每次时间为3分钟；再将韧带取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，温度为25℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理2小时；取出脱细胞肌腱置于保护液中漂洗2小时。对照组的酶与去垢剂和最后的漂洗处理均在BSS中进行。

对制备的脱细胞肌腱/韧带的组织结构带行染色。取脱细胞后的肌腱两组标本给予石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，与正常肌腱作比较。快速冷冻切片，常规苏木素-伊红(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美国)荧光染色，检测脱细胞程度。结果：脱细胞肌腱的组织切片中无DAPI阳性染色，表明无DNA残留。使用本脱细胞保护液保护的肌腱组织结构基本完整，细胞脱除干净。而对照组，经脱细胞后组织水肿明显，组织纤维排列紊乱。

本发明的实施例3

使用脱细胞保护液对眼结膜组织脱细胞的效果和组织结构观察及检测

新鲜猪宰后2小时内取出眼结膜组织，尽可能去除结膜下的组织，无菌处理，将眼结膜组织切成0.5cm×1cm的组织片，其中眼结膜组织5片密封在盛有10ml实施例1所配保存液的塑料袋中；另对照组为眼结膜组织5片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于300MP高静压条件下，处理3次，每次时间为1分钟；再将眼结膜组织取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，温度为25℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理1小时；取出脱细胞眼结膜置于保护液中漂洗1小时。对照组的酶与去垢剂和最后的漂洗处理均在BSS中进行。

对制备的脱细胞眼结膜的组织结构带行染色。取脱细胞后的眼结膜组织两组标本给予石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，与正常眼结膜组织作比较。快速冷冻切片，常规苏木素-伊红(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美国)荧光染色，检测脱细胞程度。结果：脱眼结膜的组织切片中无DAPI阳性染色，表明无DNA残留。使用本脱细胞保护液保护的肌腱和韧带组织结构基本完整，细胞脱除干净。而对照组，经脱细胞后眼结膜上皮脱落，组织纤维排列紊乱。

本发明的实施例4

使用脱细胞保护液对血管组织脱细胞的效果和结构观察及检测

新鲜猪宰后4小时内取出心脏动脉血管组织，无菌处理，将血管组织切开，铺平为1X1.5cm的组织片，血管组织5片密封在盛有10ml的实施例1所配保护液的塑料袋中；另对照组为血管组织5片密封在盛有10ml BSS的塑料袋中。于500MP高静压条件下，处理5次，每次时间为5分钟；再将血管组织取出后，置于含0.2％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，温度为25℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理2小时；取出血管组织置于保护液中漂洗2小时。对照组的酶与去垢剂和最后的漂洗处理均在BSS中进行。

对制备的脱细胞血管的组织结构带行染色。取脱细胞后的血管组织，两组标本给予石蜡包埋，切片(5μm)、HE染色观察。观察细胞核成分(苏木素染色)，胶原排列形态(伊红染色)，与正常血管组织作比较。快速冷冻切片，常规苏木素-伊红(HE)染色和二脒基苯基吲哚(DAPI)(Invitrogen，美国)荧光染色，检测脱细胞程度。结果：脱细胞血管的组织切片中无DAPI阳性染色，表明无DNA残留。使用本细胞保护液保护的血管组织结构基本完整，细胞脱除干净。而对照组，经脱细胞后原有的血管组织结构受损，纤维断裂，水肿明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。