一种柚子种质花粉的超低温保存方法与流程

本发明涉及植物超低温保存方法，具体涉及一种柚子种质花粉的超低温保存方法。

背景技术：

柚种质(Citrus grandis(L.)Osbeck)是一类重要的种质资源，是芸香科柑橘属植物，原产于亚洲。柚果形美观，味道鲜美，营养丰富，经济价值高，近年来国内外对其的开发利用方兴未艾。我国柚产区自然环境优越，生态条件复杂。加之柚的单胚性，实生繁殖极易产生变异，数千年来形成了极其丰富的种质资源。据不完全统计，全国柚种质资源的品种、品系、类型和株系在200个以上。各地柚类在形态、成熟期上存在广泛的差异，表现出丰富的遗传多样性。为了保护柚的遗传多样性，亟需收集和保存不同柚品种的种质资源。

对柚种质的保存，目前主要采用圃位保存，即以田间种植方式进行，但该方式不仅占用耕地，还需耗费大量人力物力进行栽培管理，干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害还可能导致种质资源丢失，因此采用田间方式不宜进行长期保存。普遍使用的常规低温种子保存方式，柚种质也不适用，有研究表明柚种子为中间型种子，脱水耐性极为敏感。对于无性繁殖作物的试管苗保存方式，曾有研究报道，以成年态柚茎段为材料，诱导腋芽萌发以建立试管苗组织培养技术体系时，由于柚为木本植物，长期暴露于室外，存有大量细菌，较难实现彻底消毒。而且，多次组织继代培养也可能会导致遗传变异，且耗费人力、物力。因此，超低温保存成为了可能的柚种质长期备份保存的重要方式。

超低温保存，即将植物细胞、组织或器官等材料保存在-150℃以下的蒸汽或液态氮，被认为是一种安全、经济、有效的适用于无性繁殖作物的长期保存方法。超低温保存技术在植物种质资源保存中的良好应用前景，使之愈来愈受到人们的重视。迄今，进行过超低温保存的植物材料已达200多种，所用材料类型包括茎尖、休眠芽、花粉、细胞、原生原体等。近年来植物材料超低温保存的报道越来越多，其中以营养繁殖为主的园艺植物的种质保存研究为最多。

已有研究报道，以柚茎尖为保存载体，初步建立了玻璃化法超低温保存技术体系，经预培养-玻璃化-恢复培养等步骤，柚茎尖存活率可达60％左右。

花粉保存研究方面，有报道曾以沙田柚花粉为对象，通过干燥含水量至13.5％，在-80℃下保存，经化冻后萌发率可达53.92％。但根据已开展的植物花粉超低温保存研究表明，花粉在液氮条件下保存，可显著延长保存时间、有效避免病虫害的侵入、有效提高育种效率，同时也为地区间、国家间的种质交换提供方便。

公开号为CN101982046B的中国专利公开了一种梨花粉长期可靠的贮藏方法，将梨花粉经干燥后装于变色硅胶盒内，外用锡纸包扎密封，进行液氮冻存超低温贮藏，待来年需要用时将贮藏的花粉依次在-73℃、-20℃、4℃中分别放置24小时进行逐步苏醒，最后于黑暗环境中恢复至室温，备用。该方法保险可靠，可有效维持梨花粉的活力，操作简单易行，节省空间，且可借鉴用于其他种质资源的保存，具有广泛的应用价值。然而，发明人通过实验发现，应用该技术方案对柚子种质花粉的超低温保存，会出现①超低温保存复苏花粉时回湿不充分，可能导致化冻后花粉不能在培养基上离体萌发；②花粉密封包装不严密，可能导致花粉浸入液氮造成冷冻伤害而失去花粉萌发活力；③超低温保存复苏花粉时，采用温度梯度逐步复苏的方式，可能增加由于升温而造成花粉细胞内的冰晶伤害，导致失去花粉萌发活力等缺陷，因此，该方法并不适用于柚子种质花粉的超低温保存。

因此，亟需提供一种针对柚子种质花粉的超低温保存方法，并尽可能提高其保存后使用时的萌发率。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是针对柚子种质花粉，提供一种适宜的超低温保存方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种柚子种质花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：

(1)花粉干燥：将花粉干燥至含水量为10～20％；

(2)花粉冻存：将干燥后的花粉密封包装，置于液氮中保存；

(3)花粉复苏：将花粉从液氮中取出，在25～37℃条件下化冻5～15min；

(4)花粉回湿0～3h；

(5)离体萌发。

所述步骤(1)～步骤(3)中的花粉可为花粉，也可为带有花粉的花药。

为了更好的提高花粉解冻后的萌发效率，本发明研发了特殊的花粉离体萌发培养基，即所述步骤(5)为：将回湿后的花粉置于含有100～150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3～1.0g/L硝酸钙，0～0.3g/L硫酸镁和0～10g/L琼脂的花粉离体萌发培养基上24～26℃暗培养16～20h。

作为优选，本发明针对柚子种质花粉优化了干燥步骤需控制的含水量，即所述步骤(1)具体为将花粉置于25～35℃条件下干燥至含水量10～20％。在该含水量下，柚子种质花粉能够具有能在超低温保存条件下，保持花粉活力，从而在化冻及回湿处理后，表现出更好的超低温离体萌发率。

进一步地，所述步骤(2)可为常规冻存手段，例如将花粉用硫酸纸包好，密封包装于冻存管内，投入液氮罐中保存。

本发明在上述基础上，特别引入了回湿步骤，即所述步骤(4)为用解剖针从冻存管中取复苏后的花粉于安培瓶中，将安培瓶置于含有过饱和硫酸铜的密闭容器中，室温下回湿0～3h，优选3h。经试验证明，该回湿步骤的引入能够显著提高柚子种质花粉解冻后的萌发率。

更进一步地，本发明通过研究发现，在针对柚子种质花粉提供超低温保存方法的基础上，更加有针对性的针对不同的柚子种质花粉采用不同的超低温保存方法，可以更加特异地提高不同柚子种质花粉解冻后的萌发率。

具体如下：

当柚子种质花粉为左氏柚种质花粉时，所述方法包括如下步骤：

(1)花粉干燥：将花粉干燥至含水量为10～20％；

(2)花粉冻存：将干燥后的花粉密封包装，置于液氮中保存；

(3)花粉复苏：将花粉从液氮中取出，在37℃条件下化冻5min；

(4)花粉回湿：取复苏后的花粉于安培瓶中，将安培瓶置于含有过饱和硫酸铜的密闭容器中，室温下回湿2～3h；

(5)离体萌发：将回湿后的花粉置于含有100-150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3-1.0g/L硝酸钙，0.0-0.3g/L硫酸镁，10g/L琼脂的花粉离体萌发培养基上25℃暗培养16～20h。

当柚子种质花粉为夔柚种质花粉时，所述方法包括如下步骤：

(1)花粉干燥：将花粉干燥至含水量为10～20％；

(2)花粉冻存：将干燥后的花粉密封包装，置于液氮中保存；

(3)花粉复苏：将花粉从液氮中取出，在37℃条件下化冻5min；

(4)花粉回湿：取复苏后的花粉于安培瓶中，将安培瓶置于含有过饱和硫酸铜的密闭容器中，室温下回湿2～3h；

(5)离体萌发：将回湿后的花粉置于含有150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，1.0g/L硝酸钙，0.3g/L硫酸镁，0-10g/L琼脂的花粉离体萌发培养基上25℃暗培养16～20h。

当柚子种质花粉为北砖柚种质花粉时，所述方法包括如下步骤：

(1)花粉干燥：将花粉干燥至含水量为10～20％；

(2)花粉冻存：将干燥后的花粉密封包装，置于液氮中保存；

(3)花粉复苏：将花粉从液氮中取出，在37℃条件下化冻5min；

(4)离体萌发：取复苏后的花粉置于含有150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3-1.0g/L硝酸钙，0.2-0.3g/L硫酸镁，0-10g/L琼脂的花粉离体萌发培养基上25℃暗培养16～20h。

在上述基础上，本发明进一步提供了前述方法在提高柚子种质花粉的超低温保存质量中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明优化并明确了适宜柚子种质花粉的超低温保存关键要素，如含水量范围、化冻条件、回湿条件、离体萌发条件等。通过对上述条件的优化和限定，显著提高了柚子种质花粉超低温保存后的萌发率。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同化冻方式和萌发培养基组分对超低温保存后柚子花粉萌发率的影响。

图2为本发明实施例2中不同回湿条件对超低温保存后柚子花粉萌发率的影响。其中：A代表左式柚-含水量10％；B代表左式柚-含水量20％；C代表夔柚-含水量10％。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 化冻方式和萌发培养基对超低温保存后花粉萌发率的影响

一、实验材料

实验所用材料为国家果树种质柑橘圃(重庆)提供的“左式柚”、“夔柚”、“北砖柚”3份柚子种质花粉。

二、实验方法和具体步骤

—花粉干燥处理：将收集的花药置于白炽灯下干燥(温度约为30℃)，干燥至含水量10～20％。

—密封包装液氮保存：将花粉进行适当干燥后，装入1.8ml冻存管(美国Nunc)中，投入液氮(CBS S3000-AB SERIES)保存。

—化冻：将装有花粉的冻存管从液氮罐中取出，进行化冻，两种方式：(1)25℃自来水冲洗化冻，时间约为15min；(2)37℃水浴快速化冻，时间约为5min。

—超低温保存后花粉离体萌发统计：采用悬滴萌发法或固体培养基萌发法在花粉离体培养基上进行离体萌发培养，其中花粉离体培养基配方具体为：100～150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3～1.0g/L硝酸钙，0.0～0.3g/L硫酸镁，0～10g/L琼脂(离体萌发培养基编号为M2，M3，M4，和M5，见表1)。离体花粉培养在25℃黑暗条件下进行过夜培养。利用显微镜(OLYMPUS SZ×16)进行花粉离体萌发率统计及照相。统计时，花粉管长度超过花粉粒直径一半视为有生命力的花粉，每次随机选取4个视野，平均每个视野约100个花粉，每组做4个重复，计算花粉萌发率。

表1花粉萌发培养基配方表

三、试验结果

实验表明，化冻方式和恢复培养基组分对柚种质花粉超低温保存离体萌发率有显著影响，结果如图1所示，左氏柚种质花粉含水量为20％的样品，经液氮保存后，37℃化冻后，在100-150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3-1.0g/L硝酸钙，0.0-0.3g/L硫酸镁，10g/L琼脂的离体萌发培养基(M3和M5)上，花粉离体平均萌发率为32-40％；夔柚种质花粉含水量为10％的样品，经液氮保存后，25℃化冻后，在含有150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，1.0g/L硝酸钙，0.3g/L硫酸镁，0-10g/L琼脂的离体萌发培养基(M2和M3培养基)上，花粉离体平均萌发率为39-43％；北砖柚种质花粉含水量为10％的样品，经液氮保存后，在含有150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3-1.0g/L硝酸钙，0.2-0.3g/L硫酸镁，0-10g/L琼脂的离体萌发培养基(M3和M4培养基)上，37℃化冻后，花粉离体平均萌发率为34-42％。

实施例2回湿对柚子花粉萌发率的影响

一、实验材料

实验所用品种为国家果树种质柑橘圃(重庆)提供的“左式柚”和“夔柚”2份柚子种质花粉。

二、实验方法和具体步骤

—花粉干燥处理：将收集的花药置于白炽灯下干燥(温度约为30℃)，干燥至含水量10～20％。获得“左式柚-含水量10％”、“左式柚-含水量20％”、“夔柚-含水量10％”3个样品。

—密封包装液氮保存：将花粉进行适当干燥后，装入1.8ml冻存管(美国Nunc)中，投入液氮(CBS S3000-AB SERIES)保存。

—化冻：将装有花粉的冻存管从液氮罐中取出，进行化冻，两种方式：(1)25℃自来水冲洗化冻，时间约为15min；(2)37℃水浴快速化冻，时间约为5min。

—回湿：用解剖针从冻存管中取10mg花粉于安培瓶中，置于含有过饱和硫酸铜的密闭容器中，室温下回湿3h。

—超低温保存后花粉离体萌发统计：采用悬滴萌发法或固体培养基萌发法在花粉离体培养基(M3和M5)上进行离体萌发培养，其中花粉离体培养基配方具体为：100～150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3～1.0g/L硝酸钙，0.0～0.3g/L硫酸镁，10g/L琼脂。离体花粉培养在25℃黑暗条件下进行过夜培养。利用显微镜(OLYMPUSSZ×16)进行花粉离体萌发率统计及照相。统计时，花粉管长度超过花粉粒直径一半视为有生命力的花粉，每次随机选取4个视野，平均每个视野约100个花粉，每组做4个重复，计算花粉萌发率。

三、试验结果

实验表明，37℃化冻并经回湿处理对柚种质花粉超低温保存存在显著影响。实验所用品种花粉超低温保存后离体平均萌发率最高可达70％。结果如图2所示，左氏柚种质花粉含水量为10％的样品，经液氮保存后，37℃化冻并经回湿处理，花粉离体平均萌发率为40-60％；左氏柚种质花粉含水量为20％的样品，经液氮保存后，37℃化冻并经回湿处理，花粉离体平均萌发率为45-52％；夔柚种质花粉含水量为10％的样品，经液氮保存后，37℃化冻并经回湿处理，花粉离体平均萌发率为70％。

另，经试验发现，北砖柚在37℃条件下化冻5min，不经回湿步骤，取复苏后的花粉置于含有150g/L蔗糖，0.1g/L硼酸，0.1g/L硝酸钾，0.3-1.0g/L硝酸钙，0.2-0.3g/L硫酸镁，0-10g/L琼脂的花粉离体萌发培养基上25℃暗培养16～20h，能够具有最高的萌发率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。