一种乌塌菜的选育及繁殖方法与流程

本发明属于十字花科芸薹属蔬菜新品种选育技术领域，涉及一种乌塌菜的选育及繁殖方法。

背景技术：

乌塌菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. rosularis Tsen，AA，2n=20）是一种十字花科芸薹属叶用蔬菜。现在乌塌菜品种的选育方法通常有三种途径：一、常规品种；二、采用细胞质雄性不育系为母本培育的杂种一代，其不育胞质主要是ogu CMS和pol CMS；三、利用自交不亲和系为母本培育的杂种一代。其中，以常规品种和细胞质雄性不育系选育的杂种一代占乌塌菜品种的主要部分。利用细胞质雄性不育系选育的F₁因优良的杂种优势，在品种的抗性和产量方面均有良好的表现。在以雄性不育为主导的新品种选育中，长期的单一胞质类型容易造成发病率增加，进而影响作物产量；同时ogu CMS胞质蜜腺退化，造成制种产量低，pol CMS胞质稳定性差，育性容易受到温度的影响，降低了杂种纯度。因此在以细胞质雄性不育系为母本的杂种优势利用中寻找和使用更多的细胞质雄性不育类型是育种家一项长期的工作内容。

花色苷是一种重要的植物次生代谢产物，其主要成分是类黄酮。据多年来的研究结果，花色苷在人类的饮食中具有生物学保健功能，比如抗肿瘤、抗癌、减缓衰老、保护肝脏等。因而，多年来培育高花色苷含量的蔬菜和粮食作物，成为植物品种选育的育种目标之一。在高花色苷含量的蔬菜品种选育中，鉴于花色苷多存在于植物的叶片中，其表型为叶片呈现紫色、红色或者蓝色，因而在叶菜类蔬菜中选育花色苷含量高的品种具有独特的优势。在芸薹属植物中，根据禹氏三角理论多个物种之间可以进行种间杂交，因而便于将多个不同来源的花色苷表达基因聚集到一个品种中。乌塌菜作为一种主要的芸薹属蔬菜，选育高花色苷含量的不育系对于选育高花色苷含量品种具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的上述缺点，本发明选育一种新的不育性稳定、彻底、不受温度及光照条件影响的乌塌菜的选育及繁殖方法，同时该不育系具有花色苷含量高、花色苷含量稳定等特点，为培育高花色苷含量的乌塌菜新品种提供新的种质资源。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种乌塌菜的选育，以大白菜细胞质雄性不育系CMS65-7为细胞质雄性不育系不育胞质的供体、紫叶（高花色苷含量）白菜自交系08-131及紫叶（高花色苷含量）芥菜自交系08-550为高花色苷性状的供体、以乌塌菜15-141为乌塌菜性状的供体。通过远缘杂交、胚挽救、种间杂交、多代连续回交，结合栽培试验、抗病性鉴定、花色苷含量鉴定及育性鉴定得到了遗传稳定、抗病性强、生长性状优良、花色苷含量高的乌塌菜细胞质雄性不育系和保持系，该不育系是不同于Ogu CMS、nap CMS、tour CMS的新型的花色苷含量高的乌塌菜细胞质雄性不育系。

一种乌塌菜的繁殖方法，具体繁殖步骤如下：

1、以大白菜细胞质雄性不育系CMS65-7为母本，以紫叶白菜自交系08-131为父本，将两者杂交后代中高花色苷的不育单株作为非轮回亲本，以乌塌菜15-141为轮回亲本回交8代，即[（CMS65-7×08-131）×15-141]BC₈F₁，完成08-131高花色苷性状、乌塌菜15-141及CMS65-7不育胞质的基因聚合，后代编号为CMS10-122；

2、以紫叶芥菜08-550为母本，与乌塌菜15-141进行远缘杂交后进行胚挽救，得到F₁；以F₁单株为非轮回亲本，15-141为轮回亲本回交8代后，选择紫叶单株再自交得到（08-550×15-141）BC₈F₂，种植（08-550×15-141）BC₈F₂，取后代未发生紫叶性状分离的亲本为将来的父本，完成含有08-550高花色苷基因的乌塌菜品系选育，编号为15-788；

3、以CMS10-122 为母本，15-788为父本，收获母本上的种子即为本发明中的高花色苷含量的乌塌菜不育系，编号为CMS15-33，收获15-788上的种子即为本发明的保持系。

本发明的积极效果是：

（1）本发明的乌塌菜细胞质雄性不育系聚合了来源于紫叶芥菜及紫叶白菜的不同高花色苷表达基因，具有花色苷含量高的特点；

（2）本发明的乌塌菜细胞质雄性不育系的不育性稳定且彻底、不受温度和光照条件影响，在中国韶关（短日照）和甘肃和政（长日照）连续4年8代种植的育性鉴定表明，其育性均表现0级，不育株率及不育度均为100%。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

参见图1，一种乌塌菜的选育，首先以常规生理生化分析方法测定了紫叶白菜自交系08-131及紫叶芥菜自交系08-550的花色苷含量及其组成成分，继而以经典遗传学分析方法确定了调控08-131及08-550紫叶性状基因的遗传规律，从而确定了控制08-131及08-550紫叶性状的基因为1对基因控制完全显性性状且两者为非同源基因；以大白菜细胞质雄性不育系CMS65-7为细胞质雄性不育系不育胞质的供体、紫叶（高花色苷含量）白菜自交系08-131及紫叶（高花色苷含量）芥菜自交系08-550为高花色苷性状的供体、以乌塌菜15-141为乌塌菜性状的供体。通过远缘杂交、胚挽救、种间杂交、多代连续回交，结合栽培试验、抗性鉴定、花色苷含量鉴定及育性鉴定得到了遗传稳定、抗病性强、生长性状优良、花色苷含量高的乌塌菜细胞质雄性不育系和保持系，该不育系是不同于Ogu CMS、nap CMS、tour CMS的新型的花色苷含量高的乌塌菜细胞质雄性不育系。

一种乌塌菜的繁殖方法，具体步骤如下：

前期生理生化分析：

一、紫叶芥菜及紫叶白菜花色苷含量测定

分别种植紫叶芥菜自交系08-550及紫叶白菜自交系08-131，于5叶期紫叶性状表现最为明显时，取大三叶，采用分光光度法分别测定其花色苷含量。

二、紫叶芥菜及紫叶白菜花色苷组分测定

1、分别于5叶期提取紫叶芥菜自交系08-550及紫叶白菜自交系08-131中花色苷；

2、将步骤1中提取的花色苷采用LC-MS方法进行组分分析；

根据一、二中结果确定紫叶芥菜08-550及紫叶白菜08-131主要成分为花色苷，同时其组成成分不同，从而确定控制紫叶芥菜08-550及紫叶白菜08-131花色苷合成的基因为不同基因。

三、08-550紫叶性状的遗传学分析

1、以紫叶芥菜08-550及绿叶芥菜08-332为亲本，分别进行正反交，得到F₁；

2、种植1中F₁，发现叶色均与08-550相同的紫色，无叶色分离；

3、将F₁自交，分别得到3个F₂群体，种植F₂群体，发现后代紫叶与绿叶分离比为3:1；

4、以F₁为母本，08-332为父本，采用人工拨蕾去雄授粉的方法得到BC₁F₁单株，BC₁F₁不同株系叶色表现型为紫叶:绿叶=1:1；

5、上述试验结果表明，08-550的紫叶性状为1对基因控制的完全显性性状。

四、08-131紫叶性状的遗传学分析

1、以紫叶白菜08-131及绿叶白菜08-426为亲本，分别进行正反交，得到F₁；

2、种植1中F₁，发现叶色均为与08-131相同的紫色，无叶色分离；

3、将F₁自交，分别得到3个F₂群体，种植F₂群体，发现后代紫叶与绿叶分离比符合3:1遗传规律；

4、以F₁为母本，08-426为父本，采用人工拨蕾去雄授粉的方法得到BC₁F₁单株， BC₁F₁不同株系叶色表现型为紫叶:绿叶=1:1；

5、上述结果表明，08-131紫叶性状为1对基因控制的完全显性性状。

不育系及保持系繁殖具体方法：

一、15-141的选育

1、将本单位选育的乌塌菜自交系10-222与10-327去雄杂交，得到F₁；

2、将F₁自交得到F₂，在F₂群体中进行抗病性试验及株型观察，选择抗病性好、株型优异的多个单株作为F₃进入下一步选育；

3、在F₃群体中，进一步进行抗病性试验及株型观察，选择优异F₄单株进行下一步选育；

4、在F₄单株中进行抗病性及株型观察试验，同时进行丰产性试验，选择抗病性好、株型及产量俱佳的F₅单株，编号为15-141。

二、保持系15-788的选育

1、以紫叶芥菜自交系08-550为母本，以15-141为父本，采用人工去雄杂交后进行胚挽救，获得（08-550×15-141）F₁；

2、以（08-550×15-141）F₁为母本，以15-141为父本，采用人工去雄杂交的方法进行回交，获得[（08-550×15-141）×15-141]BC₁F₁单株；

3、将2中获得的 [（08-550×15-141）×15-141]BC₁F₁自交后获得[（08-550×15-141）×15-141]BC₁F₂，在[（08-550×15-141）×15-141]BC₁F₂群体中选择紫色最深的单株作为母本，以15-141为父本，采用人工去雄杂交的方法获得杂交后代[（08-550×15-141）×15-141]BC₂F₁；

4、以3中的[（08-550×15-141）×15-141]BC₂F₁紫叶最深单株为母本，15-141为父本，采用人工去雄杂交的方法进行回交，获得[（08-550×15-141）×15-141]BC₃F₁；

5、以4中[（08-550×15-141）×15-141]BC₃F₁表型最深的紫色单株为母本，15-141为父本，采用人工去雄方法进行回交，获得[（08-550×15-141）×15-141]BC₄F₁；

6、如5所示，以杂交后代中表现为颜色最深的紫色单株为非轮回亲本，以15-141为轮回亲本，回交8次，获得[（08-550×15-141）×15-141]BC₈F₁；

7、将[（08-550×15-141）×15-141]BC₈F₁群体以单株为单位，套袋自交同时做好标识，得到[（08-550×15-141）×15-141]BC₈F₂株系，将[（08-550×15-141）×15-141]BC₈F₂每个株系中取部分种子双行种植，选择表型为紫色叶片，同时没有性状分离的株系，确定该株系为纯合单株，将该单株作为保持系，编号为15-788。

三、不育胞质来源的选择

选用华中农业大学选育的大白菜细胞质雄性不育系（专利公开号为：CN 1849881A）为母本材料，经过育性鉴定及抗性试验、长势观察，选择长势优良、抗病性好的不育单株为母本编号为CMS63-5。

四、紫叶乌塌菜不育系CMS10-122的选育

1、以CMS63-5为母本，紫叶白菜自交系08-131为父本，采用人工拨蕾授粉的方法获得杂交后代（CMS63-5×08-131）F₁；

2、对（CMS63-5×08-131）F₁进行育性鉴定及表型观察，选择不育性好，紫叶性状最明显的单株为母本，以15-141为父本，采用人工拨蕾授粉的方法获得[（CMS63-5×08-131）×15-141]F₁，同时15-141套袋自交留种备用；

3、将[（CMS63-5×08-131）×15-141]F₁及15-141群体小区种植，进行叶色观察、抗病性试验、株型观察及育性鉴定，选择紫叶性状最明显、株型好、抗病性强、同时不育的单株为母本，选择15-141中抗病性好，株型优良的单株为父本，采用拨蕾人工授粉方式进行杂交，获得[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₁F₁群体；

4、重复3中步骤，以[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₁F₁中紫叶最明显的不育单株为母本，15-141为父本，获得[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₂F₁群体；

5、重复4中步骤，以[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₂F₁中紫叶最明显的不育单株为母本，15-141为父本，获得[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₃F₁群体；

6、在回交8代的基础上，获得[（CMS63-5×08-131）×15-141]BC₈F₁不育群体，其编号为CMS10-122。

五、乌塌菜不育系CMS15-33及保持系的扩繁

1、将CMS10-122及15-788隔行种植，行数比例为3:1，待初花期以网罩方法进行繁种；

2、分别收获CMS10-122及15-788种子，第二年分别进行花色苷含量鉴定、抗病性鉴定、长势测定及育性鉴定，结果CMS10-122所收获的种子全部为不育单株，同时叶片呈深紫色、花色苷含量高，15-788上收获种子全部为可育单株，叶片呈现紫色、并长势好，抗病性强。CMS10-122上所收获种子为本发明中的不育系，编号为CMS15-33，15-788上所收获种子为本发明中的保持系。