本发明属于猪繁殖技术领域，具体涉及一种猪精液长效稀释粉及其应用。
背景技术：
猪人工授精技术是用人工器械采集公猪精液并对精液进行品质检查和稀释后，再用器械将精液注入发情母猪生殖道内，以代替公猪自然交配的一种配种方法，20世纪80年代在世界范围内迅速普及，目前在使用比较广的欧洲和北美等地区，普及率已超过80％，是进行科学养猪、实现养猪生产现代化的重要手段，它有如下优点：(1)节省公猪，并减少每头公猪的使用次数，克服时间和区域差异，可以方便地适时配种；(2)节省人力、物力、财力，提高经济效益，减少疾病的传播；(3)提高配种率，由于可以利用显微镜、密度仪等仪器对精子质量进行监控，有效提高了配种受胎率，并可及时调整精子质量较差的公猪；(4)增加遗传性能优良的公猪的利用率，扩大良种覆盖率，有利于品种改良和联合育种。
在开展猪的人工授精工作中，必须配制公猪精液的稀释液，以便稀释保存。
申请号201310478237.6公开了一种猪精液稀释剂，申请号201010133910.9公开了一种猪精液常温保存稀释剂及其制备和稀释方法，保存精液时间均只有3天；申请号201410164618.1的猪抗病毒精液稀释液，保存精液时间只有4天。
申请号为201410527131.5的发明公开了一种猪抗病毒长效精液稀释液配方及制备方法，保存精液的时间为5-7天，其缺陷是在制备时配方中的聚乙烯乙醇需要在加热电磁搅拌器上溶解于150ml 30-50℃的蒸馏水中，搅拌20-40分钟，制备麻烦。
与本发明密切相关的申请号201210238501.4的发明公开了一种长效猪精液稀释粉及其制备方法，猪精液的保存时间为10-12天，但是其中的鸡卵黄干粉制备方法复杂，制备过程中被污染的几率大，需要相应的干燥设备，质保期短。
所以开发出保存猪精液时间长、制备简便的猪精液稀释粉对人工授精技术具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种猪精液长效稀释粉及其应用，本发明取材容易、制备简便、易于贮存，应用本发明的猪长效精液稀释粉的精液保存时间可长达11-13天。
本发明的另一个目的，是提供一种猪精液长效稀释粉的应用方法。
本发明的技术方案如下所述：
一种猪精液长效稀释粉，它是由以下重量份的组分混合配制而成：葡萄糖27-30g，二水柠檬酸三钠6-7g，一水柠檬酸2-3g，乙二胺四乙酸2-3g，碳酸氢钠0.5-1g，氯化钾0.3-0.6g，三羟甲基氨基甲烷5-6g，牛血清白蛋白3-4g和抗菌素恩诺沙星0.1-0.3g。
作为优选配方，本发明的猪精液长效稀释粉，它是由以下重量份的组分混合配制而成：葡萄糖27.69g，二水柠檬酸三钠6.03g，一水柠檬酸2.52g，乙二胺四乙酸2.03g，碳酸氢钠0.83g，氯化钾0.46g，三羟甲基氨基甲烷5.08g，牛血清白蛋白3.69g和抗菌素恩诺沙星0.18g。
一种猪精液长效稀释粉的应用方法，包括如下步骤：采集公猪精液，测定得到渗透压为301.25±14.52mmol/kg、PH值为7.04±0.05，根据猪精液长效稀释粉的配制目的--对精子无害，能提供精子营养，pH范围适合精子存活，渗透压适当，原料易得、配置简单，长效保存，进行组分的筛选工作，筛选得到的各组分是：葡萄糖、二水柠檬酸三钠(C6H5Na307.2H2O)、一水柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、碳酸氢钠(NaHCo3)、氯化钾(Kcl)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、牛血清白蛋白(BSA)和抗菌素恩诺沙星。
根据测定公猪精液得到的渗透压和PH值以及课题组先期的预配方试验结果，将氯化钾、牛血清白蛋白和恩诺沙星作为主要变化因素，梯度水平为3，采用L9(34)表格进行试验，3个重复(3头公猪的精液)，筛选配方。然后进行配方的进一步优化，调节理化参数，以渗透压为主，进行渗透压梯度试验，S1(265mmol/kg)、S2(277mmol/kg)、S3(288mmol/kg)、S4(309mmol/kg)、S5(318mmol/kg)，观测精子活力，经过渗透压梯度试验，发现渗透压在300-310左右为最佳，按最佳渗透压将配方进一步优化，每个试验周期为13天左右，直到绝大多数精液样品活力降低到0.6以后停止检测，然后分析获得最佳的配方组合，优化后的配方稀释精液，保存11-13天，精子活力为0.60。
本发明的有益效果是：
自然交配时，一头公猪每年可承担25头母猪进行本交的配种负荷，而采用人工授精，一头公猪1年可配250头以上母猪，人工授精与本交相比较，其优点是可以节省公猪的饲养量。应用本发明长效稀释粉稀释猪精液进行人工授精，可以减少人工授精过程中的消毒和配稀释液、稀释精液的次数，猪精液在一定长的时间内保存起来以便随时使用，节能省事。用本发明配制的猪精液长效稀释粉稀释的猪精液在温度为17℃的恒温条件下，可以保存11-13天。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围；实施例所用原料采用分析纯级别，所有步骤均在净化空间进行，净化空间的洁净度要求为30万级。
实施例1
一种猪精液长效稀释粉，它是由下述重量份的组分混合配制而成：葡萄糖30.00g，二水柠檬酸三钠6.53g，一水柠檬酸2.73g，乙二胺四乙酸2.20g，碳酸氢钠0.90g，氯化钾0.50g，三羟甲基氨基甲烷5.50g，牛血清白蛋白4.00g和抗菌素恩诺沙星0.20g。
试验方法：
(1)实施例原料采用分析纯级别，称量、真空包装后密封，得到稀释粉，温度为2-8℃、相对湿度为50％以下的条件下保存。
(2)使用稀释粉时，用加热至35-37℃的二次蒸馏水搅拌，混合均匀，定容到1000ml，得到精液稀释液，1.5小时后用于猪精液的稀释。
(3)猪精液采集后，将气味、颜色正常的猪精液先用精子密度仪检测密度，再在预热37℃玻片上100倍显微镜下镜检精子活力，活力达0.9级以上的猪精液用公式计算稀释的份数：重量×密度×活力÷30＝份数(30是指每份精液有效精子数30亿)。
(4)精液稀释液与猪精液温差不能超过1℃，并且通过调整精液稀释液的温度使猪精液与精液稀释液的温度尽可能的接近，不能反向操作。
(5)稀释猪精液时将精液稀释液沿容器壁缓慢倒入到猪精液中，落差不要大，以不起泡沫为准，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌，使两者轻柔混匀；按体积计算，如作1：2-4倍的高倍稀释时，应先作1：1-1.5倍的低倍稀释，待半分钟后在将余下的精液稀释液沿容器壁缓慢加入，不可反过来将猪精液倒入精液稀释液中。所有稀释操作都要在室温23-25℃环境下，30min内完成。
(6)将稀释后的猪精液缓慢装入洁净的精液瓶或精液袋中，以整个精液瓶或精液袋容积计算，空气含量6-7％，密闭精液瓶或精液袋，减少精子与氧气接触，抑制精子的代谢，延长精液的保存时间，在23-25℃室温下避光缓慢降温1个小时后(也可用洁净的干的纯棉大毛巾包裹2层后)放置于17℃恒温箱中保存，每隔8小时缓慢摇动精液，避免精子沉积造成伤亡。每隔24小时检测一次精子活力。
(7)室内禁止吸烟，女操作员不能使用气味浓重的化妆品，与精液接触的温度计、玻璃棒、稀释杯、稀释水37℃预热。在猪精液的运输过程中要避免阳光照射、避免颠簸震动、避免温差大起大落。使用专门的恒温运输箱或者泡沫箱，夏天放冰水袋，冬天放棉毛巾，保持箱内温度为15-20℃。
本实施例的实施效果见表1。
表1公猪精液17℃恒温保存活力变化统计
实施例2
一种猪精液长效稀释粉最佳配方由如下重量份的组分混合配制而成：葡萄糖27.69g，二水柠檬酸三钠6.03g，一水柠檬酸2.52g，乙二胺四乙酸2.03g，碳酸氢钠0.83g，氯化钾0.46g，三羟甲基氨基甲烷5.08g，牛血清白蛋白3.69g和抗菌素恩诺沙星0.18g。
试验方法：
(1)实施例原料采用分析纯级别，称量、真空包装后密封，得到稀释粉，温度为2-8℃、相对湿度为50％以下的条件下保存。
(2)使用稀释粉时，用加热至35-37℃的二次蒸馏水搅拌，混合均匀，定容到1000ml，得到精液稀释液，1.5小时后用于猪精液的稀释。
(3)猪精液采集后，将气味、颜色正常的猪精液先用精子密度仪检测密度，再在预热37℃玻片上100倍显微镜下镜检精子活力，活力达0.9级以上的猪精液用公式计算稀释的份数：重量×密度×活力÷30＝份数(30是指每份精液有效精子数30亿)。
(4)精液稀释液与猪精液温差不能超过1℃，并且通过调整精液稀释液的温度使猪精液与精液稀释液的温度尽可能的接近，不能反向操作。
(5)稀释猪精液时将精液稀释液沿容器壁缓慢倒入到猪精液中，落差不要大，以不起泡沫为准，然后轻轻摇动或用消毒玻璃棒搅拌，使两者轻柔混匀；按体积计算，如作1：2-4倍的高倍稀释时，应先作1：1-1.5倍的低倍稀释，待半分钟后在将余下的精液稀释液沿容器壁缓慢加入，不可反过来将猪精液倒入精液稀释液中。所有稀释操作都要在室温23-25℃环境下，30min内完成。
(6)将稀释后的猪精液缓慢装入洁净的精液瓶或精液袋中，以整个精液瓶或精液袋容积计算，空气含量6-7％，密闭精液瓶或精液袋，减少精子与氧气接触，抑制精子的代谢，延长精液的保存时间，在23-25℃室温下避光缓慢降温1个小时后(也可用洁净的干的纯棉大毛巾包裹2层后)放置于17℃恒温箱中保存，每隔8小时缓慢摇动精液，避免精子沉积造成伤亡。每隔24小时检测一次精子活力。
(7)室内禁止吸烟，女操作员不能使用气味浓重的化妆品，与精液接触的温度计、玻璃棒、稀释杯、稀释水37℃预热。在猪精液的运输过程中要避免阳光照射、避免颠簸震动、避免温差大起大落。使用专门的恒温运输箱或者泡沫箱，夏天放冰水袋，冬天放棉毛巾，保持箱内温度为15-20℃。
本实施例的实施效果见表1。
用优化后的猪精液长效稀释粉配方稀释后的猪精液，可保存11-13天，精子活力为0.60。试验表明，直线前进运动的精子占总精子数在60-95％，人工授精母猪的妊娠率无显著差异。