线粒体靶向的活性氧拮抗剂延缓储存血小板凋亡的方法与流程

本发明属于延缓储存血小板凋亡领域，具体涉及一种线粒体靶向的活性氧拮抗剂延缓储存血小板凋亡的方法。

背景技术：

血小板在长期内被看作是血液中的无功能的细胞碎片。血小板具有特定的形态结构和生化组成，在正常血液中有较恒定的数量(如人的血小板数为每立方毫米10~30万)，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。

国际上常规的血小板储存条件是在22±2°C震荡保存，期限为5天。由于储存时间短，一方面造成大量的血小板浪费，另一方面也引起血库血小板紧缺。血小板储存期限主要受到细菌污染和血小板发生PSL两个因素的影响。随着血小板采集和无菌技术的发展，细菌污染造成的影响已降到很低，目前影响血小板储存期限的主要因素是血小板发生了PSL（血小板储存损伤）。2000年，Li等首次研究发现储存血小板能够发生凋亡，之后很多研究进一步证实储存血小板的确能够发生凋亡。

从志愿者分离得到的血小板，绝大多数都处于静息状态，随着储存时间的延长，发生凋亡的血小板数量逐渐增多。问题是：在没有受到外在刺激的情况下，储存袋内静息的血小板如何发生凋亡。最近，Canault等研究报道，抑制p38 MAPK活性改善储存血小板输注到小鼠体内的止血功能可知p38 MAPK参与能引起PSL。另外，Hayashi等使用线粒体氧化-磷酸化的解偶联剂和呼吸链复合物III抑制剂，发现损伤线粒体功能加速PSL的发生，表明线粒体可能参与引起PSL。

活性氧（reactive oxygen species, ROS）包括超氧阴离子、羟自由基和H₂O₂等；线粒体呼吸链、NAD(P)H氧化酶、黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧化酶等都能产生ROS；ROS的清除主要通过各种酶（如，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等）和非酶的物质（如，谷胱甘肽、维生素C等）。在生理状态，ROS主要由线粒体呼吸链产生，大约1-3%的电子从线粒体呼吸链漏出与O₂反应生成超氧阴离子。细胞内ROS的产生与清除之间保持动态平衡，ROS维持在生理水平，在细胞增殖、分化等的信号转导中起重要作用。当ROS产生过多或ROS清除障碍时，细胞内ROS会过度堆积，引起细胞凋亡或坏死。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种线粒体靶向的活性氧拮抗剂延缓储存血小板凋亡的方法，该方法能够延缓储存血小板凋亡。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种线粒体靶向的活性氧拮抗剂延缓储存血小板凋亡的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，分组：将单采血小板分为3组：Mito-TEMPO组，溶剂对照组，正常对照组，在22±2°C震荡保存7天，然后利用无菌接管机分别在保存1天、3天、5天、和7天时均取5-10ml的单采血小板，

步骤2，制备洗涤血小板：

所述制备洗涤血小板包括以下步骤：a、离心，首先，将所述步骤1已取出的单采血小板分别进行离心处理，弃上清液，得到沉淀的血小板，b、洗涤，用第一缓冲液悬浮并离心、洗涤所述a得到的沉淀的血小板，然后重复步骤b一次，c、重悬，用第二缓冲液重悬所述b洗涤后得到的血小板，得到血小板悬液，d、计数，用计数板对血小板进行计数，得到洗涤血小板，调整洗涤血小板至浓度为3 ×10⁸个/ml，室温静置60 min；

步骤3，检测血小板的凋亡指标：将所述步骤2制得的洗涤血小板进行血小板ΔΨm去极化检测，或将所述步骤2制得的洗涤血小板进行血小板PS暴露检测。

所述步骤a离心时在相对离心力1500 × g 下，离心20 min。

所述步骤b第一次洗涤时采用的第一缓冲液为CGS缓冲液，所述CGS缓冲液包含0.123 M 氯化钠，0.033 M 葡萄糖，0.013 M柠檬酸钠，所述CGS缓冲液pH 为6.5。

所述步骤c中第二次洗涤所采用的第二缓冲液为修改的Tyrode’s缓冲液MTB，所述修改的Tyrode’s缓冲液MTB包含：2.5 mM Hepes，150 mM氯化钠，2.5 mM氯化钾，1 mM氯化钙，1mM氯化镁，12mM碳酸氢钠，5.5 mM葡萄糖，所述修改的Tyrode’s缓冲液MTB的pH值为 7.4。

所述步骤2中洗涤血小板进行血小板ΔΨm去极化检测包括以下步骤：将所述步骤1制得的浓度为3 ×10⁸个/ml的洗涤血小板用MTB将洗涤血小板稀释至5 × 10⁷ 个/ml，每管取50μl浓度为5 × 10⁷个ml稀释后的洗涤血小板，加入终摩尔浓度为100 nM的TMRE，在避光震荡条件下37 °C下孵育20 min，每管加入250 μl MTB，采用流式细胞仪进行检测。

所述血小板ΔΨm去极化检测结果为，发生ΔΨm去极化的血小板百分比为：第3天溶剂对照组为3.4±0.9%，Mito-TEMPO组为2.0±0.7%；第5天溶剂对照组为7.2±1.3%，Mito-TEMPO组为4.7±0.8%；第7天溶剂对照组为11.4±1.6%，Mito-TEMPO组为8.0±1.2%。

所述步骤2制得的洗涤血小板进行血小板PS暴露包括以下步骤：将所述步骤1制得的浓度为3 ×10⁸个/ml的洗涤血小板用MTB将洗涤血小板稀释至5 × 10⁷ 个/ml，每管取50μl浓度为5 × 10⁷个ml稀释后的洗涤血小板，加入250μl 1× annexin V结合缓冲液和5μl FITC标记的annexin V在避光震荡条件下室温孵育30 min后，采用流式细胞仪进行检测。

所述血小板PS暴露检测结果为，发生PS外翻的血小板百分比为：第3天溶剂对照组为5.1±1.2%，Mito-TEMPO组为3.6±0.7%；第5天溶剂对照组为10.9±1.1%，Mito-TEMPO组为6.8±0.9%；第7天溶剂对照组为18.0±1.9%，Mito-TEMPO组为13.1±1.4%。

本发明步骤2中制备洗涤血小板的所有步骤、步骤3中检测血小板凋亡指标的所有步骤和方法均是针对步骤1单采血小板分3组后分别保存1天、3天、5天、和7天的时候取出的单采血小板进行的，即当天取样后即进行试验操作。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：①本发明通过线粒体靶向的活性氧拮抗剂（Mito-TEMPO）明显降低保存血小板的线粒体跨膜电位去极化；②本发明通过线粒体靶向的活性氧拮抗剂（Mito-TEMPO）明显降低保存血小板的磷酯酰丝氨酸的外翻，从而延缓储存血小板的凋亡。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明针对3组单采血小板（Mito-TEMPO组，溶剂对照组，正常对照组）处理后的洗涤血小板进行血小板ΔΨm去极化检测结果图。

图2为本发明针对3组单采血小板（Mito-TEMPO组，溶剂对照组，正常对照组）处理后的洗涤血小板进行血小板PS暴露检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施举例和附图对本发明作进一步说明，但不应以此限制本发明的保护范围。

如图1和图2所示，本实施例线粒体靶向的活性氧拮抗剂延缓储存血小板凋亡的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，分组：将单采血小板分为3组：Mito-TEMPO组，溶剂对照组，正常对照组，在22±2°C震荡保存7天，然后利用无菌接管机分别在保存1天、3天、5天、和7天时均取5-10ml的单采血小板，

步骤2，制备洗涤血小板：

所述制备洗涤血小板包括以下步骤：a、离心，首先，将所述步骤1已取出的单采血小板进行离心处理，弃上清液，得到沉淀的血小板，b、洗涤，用第一缓冲液悬浮并离心、洗涤所述a得到的沉淀的血小板，然后重复步骤b一次，c、重悬，用第二缓冲液重悬所述b洗涤后得到的血小板，得到血小板悬液，d、计数，用计数板对血小板进行计数，得到洗涤血小板，调整洗涤血小板至浓度为3 ×10⁸个/ml，室温静置60 min；

步骤3，检测血小板的凋亡指标：将所述步骤2制得的洗涤血小板进行血小板ΔΨm去极化检测，或将所述步骤2制得的洗涤血小板进行血小板PS暴露。

作为优选，本实施例步骤a离心时在相对离心力1500 × g 下，离心20 min。

作为进一步优选，本实施例步骤b第一次洗涤时采用的第一缓冲液为CGS缓冲液，所述CGS缓冲液包含0.123 M 氯化钠，0.033 M 葡萄糖，0.013 M柠檬酸钠，所述CGS缓冲液pH 为6.5；所述步骤c中第二次洗涤所采用的第二缓冲液为修改的Tyrode’s缓冲液MTB，所述修改的Tyrode’s缓冲液MTB包含：2.5 mM Hepes，150 mM氯化钠，2.5 mM氯化钾，1 mM氯化钙，1mM氯化镁，12mM碳酸氢钠，5.5 mM葡萄糖，所述修改的Tyrode’s缓冲液MTB的pH值为 7.4。

本实施例步骤2中洗涤血小板进行血小板ΔΨm去极化检测包括以下步骤：将所述步骤1制得的浓度为3 ×10⁸个/ml的洗涤血小板用MTB（指修改的Tyrode’s缓冲液）将洗涤血小板稀释至5 × 10⁷ 个/ml，每管取50μl浓度为5 × 10⁷个ml稀释后的洗涤血小板，加入终摩尔浓度为100 nM的TMRE（四甲基罗丹明乙酯），在避光震荡条件下37 °C下孵育20 min，每管加入250 μl MTB（指修改的Tyrode’s缓冲液），采用流式细胞仪进行检测，血小板ΔΨm去极化检测结果为，发生ΔΨm去极化的血小板百分比为：第3天溶剂对照组为3.4%，Mito-TEMPO组为2.0%；第5天溶剂对照组为7.2%，Mito-TEMPO组为4.7%；第7天溶剂对照组为11.4%，Mito-TEMPO组为8.0%。本实施例中图1结果显示从第3天开始，第3天、第5天、第7天分别与溶剂对照组（Solvent control）比较，线粒体靶向的活性氧拮抗剂（Mito-TEMPO）明显降低保存血小板的线粒体跨膜电位（ΔΨm）去极化。

本实施例步骤2制得的洗涤血小板进行血小板PS暴露包括以下步骤：将所述步骤1制得的浓度为3 ×10⁸个/ml的洗涤血小板用MTB将洗涤血小板稀释至5 × 10⁷ 个/ml，每管取50μl浓度为5 × 10⁷个ml稀释后的洗涤血小板，加入250μl 1× annexin V结合缓冲液和5μl FITC（异硫氰酸荧光素）标记的annexin V在避光震荡条件下室温孵育30 min后，采用流式细胞仪进行检测，血小板PS暴露检测结果为，发生PS外翻的血小板百分比为：第3天溶剂对照组为5.1%，Mito-TEMPO组为3.6%；第5天溶剂对照组为10.9%，Mito-TEMPO组为6.8%；第7天溶剂对照组为18.0%，Mito-TEMPO组为13.1%。本实施例图2结果显示从第3天开始，第3天、第5天、第7天分别与溶剂对照组（Solvent control）比较，线粒体靶向的活性氧拮抗剂（Mito-TEMPO）明显降低保存血小板的磷酯酰丝氨酸（PS）的外翻。

尽管上述实施例已对本发明作出具体描述，但是对于本领域的普通技术人员来说，应该理解为可以在不脱离本发明的精神以及范围之内基于本发明公开的内容进行修改或改进，这些修改和改进都在本发明的精神以及范围之内。