一种面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置及其控制方法与流程

本发明涉及到生物材料玻璃化保存中的降/复温领域，具体为一种面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置及其控制方法。

背景技术：

低温保存是众多生物材料目前唯一有效的长期保存手段，在国计民生的众多领域都发挥着不可替代的作用。在临床医学领域，越来越多的疾病可以通过细胞和组织的移植而得到医治，大规模的低温保存则是解决这些重要生物材料临床供应问题的重要手段。低温保存的生物材料需要经历从常温至低温的跨越，这一过程中冰晶生长是保存成功的最大障碍。玻璃化保存是一种革命性的新方法，在玻璃化保存的过程中生物样品内不产生(或仅产生极少量)冰晶，溶液的浓度无明显变化，过冷时间短，因此能有效避免各种因素导致的低温损伤，相对传统方法有原理性的突破。

为了获得玻璃化转变所需的超高降复温速率，标准方法中使用细管(French Mini-straw,0.25ml)承载微量样品并直接投入液氮(-196℃)，通过样品与液氮间的巨大的温差以及液氮在细管表面的汽化作用驱动样品迅速降温，在复温环节，则将细管直接投入恒温水浴(约30℃)中，以样品和温水间的温差驱动样品快速升温。在此基础上，Vajta等人改进了细管的结构，提出了开放式拉长细管法(Open Pulled Straw，OPS)，所得到的降温速率大大提高。Reubinnoff也应用了这种方法首次成功进行了干细胞玻璃化低温保存中，后续研究对这种方法进行了持续的改进，先后出现了封口式拉长细管法(Closed Pulled Straw，CPS)、微量吸头法(Micropipette)、Cryotop及Cryotip等方法。

无论结构如何改进，以上方法中承载样品的各种容器在降温或复温过程中都会对样品与工作液体，如制冷剂(液氮)或复温剂(温水)间的换热起一定的热阻作用。为了消除容器的影响，另一部分研究中采用了直接接触的方式，即使得微量样品与制冷剂或复温剂直接接触，实现更高的换热效率。典型方法包电镜网法(Electron Mmicroscope Grids，EMG)、冷环法(Cryoloop)等，分别用精细的铜网及尼龙环承载微量的细胞。近期研究中还出现一种细胞微滴法(Micro Droplet，MD)，利用微流控芯片生成包裹细胞的微滴，并直接滴入到液氮中降温。这类方法能获得较高的降复温速率，但需要解决细胞的回收及直接接触带来的污染问题。

总的来说，虽然玻璃化保存方法研究已经取得了一系列成果，但现有降复温技术仍不成熟，表现在：

(1)换热效率有限。现有的降温方法从本质上来说都是通过样品在液氮中的池沸腾(Pool boiling)来获得较高的降温速率，但池沸腾过程中会产生大量的液氮蒸汽包裹在样品周围，对进一步的降温产生隔热的作用，因此换热系数一般较低；对复温过程来说，现有复温方法一般通过样品与恒温水浴间的温差驱动升温，换热效率更低，而且随着样品温度回升、温差减小，复温速率迅速衰减，很容易产生反玻璃化等问题；

(2)操作偶然因素影响大。将样品浸入液氮实现降温和投入恒温浴实现复温的方式，工质被动的作用于生物样品或载体，降复温速率难以控制，缺乏稳定性和一致性，并且无法调节。

技术实现要素：

针对上述存在的问题或不足，为了解决玻璃化保存中存在的换热效率有限、操作偶然因素影响大等问题，本发明提供了一种面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置及其控制方法。

具体技术方案如下：

该面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置，包括高压惰性气体输入端、压力调节阀、球阀、降复温工质容器、样品段和储液槽，通过导管采用串联的方式将上述部件依次进行连接，如图1所示。

本发明利用高压惰性气体作为驱动，驱动降复温容器中的降复温工质高速运动通过样品段，并作用在样品或其载体上，从而实现样品的降复温。

另外，使用压力调节阀调节输入至降复温工质容器的高压惰性气体的压强，使用球阀用于开关，控制输入高压惰性气体的通断。并可通过压力调节阀调整驱动压强的方式实现降复温速率的调节。

所述高压惰性气体输入端通入的高压惰性气体为压强在0.1Mpa及以上的氮气。

所述导管，其内壁为聚四氟乙烯材质，能够耐受‐200℃低温，外部包裹隔热材料，隔热材料材质为泡沫。

所述样品段，存放需要玻璃化保存的样品或其载体，并设有入口和出口；设有降复温工质的流道，降复温工质在样品段中高速运动过程中作用在样品上进行高强度换热。

所述降复温工质，包含液氮和酒精溶液，其中液氮用于降温，酒精溶液用于复温。

所述降复温工质容器，储存降复温工质。降复温工质容器由外部高强度外壳和内部的保温材料组成，并带有输入端口和输出端口，其中输入端口联通内部空间的顶层，输出端口接通内部空间的底部，当输入端口接通高压惰性气体时，降复温工质容器中的降复温工质在高压作用下经输出端口高速输出。降复温工质容器的输出端口通过导管与样品段入口相连。使用时降复温工质不接触降复温工质容器的输入端口，淹没降复温工质容器的输出端口

所述压力调节阀，调节输入至降复温工质容器输入端口的高压惰性气体的压强，压力调节阀压强调节范围为0.1Mpa至20Mpa。

所述球阀，用于开关，控制输入至降复温工质容器的高压惰性气体的通断。

所述储液槽是一容器，通过导管与样品段的出口相连，用于收集通过样品段后的降复温工质。

上述面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置的降复温过程如下：

通过高压惰性气体驱动降复温工质容器中的降复温工质，使降复温工质高速运动并作用在样品段内的样品或其载体上，实现样品的超高速降复温。

本发明利用高压惰性气体驱动技术，提出了一种面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置及其控制方法。该方法旨在通过高压惰性气体来驱动降复温工质高速运动并作用在样品或其载体上，作用方式变被动为主动。从而实现更高的换热效率以及更好的过程稳定性和一致性。此外，通过调节高压气体的压强，可改变工质的作用速率，从而实现降复温速率的大范围调节，可适应不同对象保存的需求。解决了传统玻璃化保存降复温工质被动方式作用于样品引起的诸多问题。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明以高压惰性气体作为驱动力，驱动降复温工质来实现样品的玻璃化保存，变现有的被动的作用方式为主动，大大提高了低温保存的稳定性和一致性。

(2)本发明通过压力调节阀来调整驱动压强，可实现对样品降复温速率的大范围调节。

附图说明

图1是本发明的结构及其控制方法示意图；

图2是本发明的降复温工质容器示意图；

图3是实施例的示意图；

图4是实施例的降温测试结果示意图；

图5是实施例的复温测试结果示意图；

附图标记：1高压惰性气体输入端，2压力调节阀，3球阀，4降复温工质容器，5降复温工质，6样品段，7储液槽，8导管，9热电偶，10数据采集卡，11计算机。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。

如图3所示，一种面向玻璃化保存的降复温工质驱动装置与控制方法示意图，包括1高压惰性气体输入端，2压力调节阀，3球阀，4降复温工质容器，5降复温工质，6样品段，7储液槽，8导管，9热电偶，10数据采集卡，11计算机。

本实施例使用的高压惰性气体为压强在0.1Mpa及以上的氮气。

导管8内壁为聚四氟乙烯材质，能够耐受‐200℃低温，外部包裹隔热材料，隔热材料材质为泡沫。

样品段6存放需要玻璃化保存的样品或其载体，样品段有入口和出口。

降复温工质5包含液氮和酒精溶液，其中液氮用于降温，酒精溶液用于复温。

E、降复温工质容器

使用降复温工质容器4储存降复温工质5。降复温工质容器4的输入端口联通内部空间的顶层，输出端口接通内部空间的底部，当输入端口接通高压惰性气体时，降复温工质容器4中的降复温工质5在高压作用下经输出端口高速输出。降复温工质容器的输出端口通过导管8与样品段6入口相连。

压力调节阀2调节输入至降复温工质容器4输入端口的高压惰性气体的压强，压力调节阀压强调节范围为0.1Mpa至20Mpa。

球阀3控制输入至降复温工质容器4中高压惰性气体的通断。

储液槽7通过导管8与样品段6出口相连。

I、温度数据采集模块

温度数据采集模块由热电偶、数据采集卡、计算机组成，热电偶探头插入步骤D中样品内，将信号传输至数据采集卡，并通过计算机处理输出。

J、降复温过程

通过高压惰性气体驱动降复温工质容器4中的降复温工质5，使降复温工质5高速运动并作用在样品段6内的样品或其载体上，实现样品的超高速降复温。

步骤如下：

a)按上述步骤完成本发明装置的的组装。

b)往降复温工质容器中添加液氮。

c)调节压力调节阀使输入至降复温工质容器中的高压惰性气体压强为0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

d)使用温度数据采集模块进行温度数据采集。

e)使用球阀控制输入高压惰性气体通路，10秒后，使用球阀控制输入高压惰性气体断路，完成样品降温过程。

f)样品段从装置中取出放入液氮罐中保存。

g)取出在液氮罐中保存的样品段，完成本发明装置的组装。

h)往降复温工质容器中添加37℃85％的酒精溶液。

i)调节压强调节装置使高压惰性气体压强为0.1Mpa(0.2Mpa,0.3Mpa,0.4Mpa,0.5Mpa,0.6Mpa,0.7Mpa)。

j)使用温度数据采集模块进行温度数据采集。

k)使用球阀控制输入高压惰性气体通路，10秒后，使用球阀控制输入高压惰性气体断路，完成样品复温过程

图4是样品在不同压强下的降温速率。图5是样品在不同压强下的复温速率。

由结果可以看出，对于降温过程，驱高压惰性气体压强的增加使得流过样品段的液氮流速变快，强化了装置换热效果。当高压惰性气体压强为0.1Mpa时，样品的降温速率降温速率达30000℃/min，而当高压惰性气体压强提高到0.6Mpa时，降温速率约为47698℃/min,这说明了本发明可以通过实验操作条件的控制实现大范围调节玻璃化保存降温速率。通过在统一实验条件下多次重复实验(次数≥3)，降温速率偏差可控制在10％左右，这说明本发明在玻璃化保存降温过程中具有稳定性和一致性。

对于复温过程，高压惰性气体压强的增加使得流过微样品段的酒精流速变快，强化装置换热效果。当高压惰性气体压强为0.1Mpa时，复温速率达16438℃/min；而当高压惰性气体压强提升到0.7Mpa时，复温速率达到约47965℃/min，这说明本发明可以通过实验操作条件的控制实现大范围调节玻璃化保存复温速率。通过在统一实验条件下的多次实验(次数≥3)，复温速率偏差可控制在10％左右，这说明本发明在玻璃化保存复温过程中具有稳定性和一致性。