本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一项在金线莲大面积栽培中应用菌根真菌以缩短金线莲生产周期，提高金线莲产量和质量的技术方法。
背景技术：
金线莲是一种名贵珍稀的中草药，为兰科开唇兰属(金线莲属)(anoectochilusblume)多年生草本植物，在我国主要分布于浙江、福建、江西、广东、广西、海南、贵州、云南、西藏、台湾等省区。金线莲是全草入药，具有清热凉血、祛风利湿、强心、降血压、解毒、止痛、镇咳等功效，民间多用于消炎、镇痛，治疗肺结核、肺热咳嗽，风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇伤等多种疾病，均有很好疗效。近年来，金线莲又被用于治疗高血压、糖尿病、肝炎及肿瘤等疑难病症，其功效日益引起医药界的重视。金线莲在民间素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，在台湾更是被称为“药王”。经测定发现，金线莲中氨基酸类成分的组成和含量，以及具有抗衰老活性的微量元素的含量均高于西洋参。
技术实现要素：
本发明地目的在于提供一种应用菌根真菌大面积栽培金线莲的方法，该方法可以提高金线莲的繁殖率和栽培成活率，可以缩短栽培金线莲的生长周期，提高金线莲的产量和质量，解决金线莲资源短缺的问题。
具体地说，本发明所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比)：
1.菌根真菌的培养
将上述4种菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于pda平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中分别进行发酵培养制成种子菌种；种子菌种可以进一步接入液体或固体培养基进行放大培养。
真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量为2-5％。培养基ph5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％。培养基灭菌后接入上述菌根真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％。菌根真菌液体培养的培养条件为：振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天。培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。
菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为：阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍。培养基ph5.0-6.5。试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％。培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％。固体培养的培养条件为：18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时(2个月左右)取出备用。
2.金线莲苗的培养
金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。经壮苗生根培养后的金线莲苗可以在继代培养基上继代培养。各步骤所用培养基及培养时间分别为：
(1)用于芽分化的培养基是以ms培养基为基本培养基，附加6-苄基腺嘌呤(6-ba)和萘乙酸(naa)，其加入量为每升(l)培养基加入6-ba0.5-3.0mg，naa0.4-2.5mg。培养时间45-120天。
(2)用于丛芽增殖的培养基是以ms培养基为基本培养基，附加6-ba、吲哚丁酸(iba)和玉米素(zt)，其加入量为每升(l)培养基加入6-ba0.5-3.0mg，iba0.3-1.5mg，zt0.05-0.3mg。培养时间45-120天。
(3)用于壮苗生根的培养基使以ms培养基为基本培养基，附加naa和iba，其加入量为每升(l)培养基加入naa0.5-3mg，iba0.5-2mg。培养时间为40-120天。
(4)用于苗继代的培养基是以1/2ms培养基为基本培养基，每升(l)培养基加入马铃薯(煮汁)100-300g。培养时间45-90天。
金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(l)ms和1/2ms基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g。壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(l)培养基中均要添加活性炭0.5-4g。培养基ph5.0-6.5。用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％。苗的培养条件为15-26℃光照培养，光照强度1500-5000lux，光照时间8-12小时/天。
3.金线莲苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理及收获
金线莲苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种：
(1)基质1中可以有蛭石和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为：蛭石∶砂子＝4∶1-4；
(2)基质3中可以有泥炭土和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为：泥炭土∶砂子＝5∶1-5；
栽培中还要用到山毛榉科fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm。
上述栽培基质中用到的腐殖土可直接使用，或高温灭菌，或提前两个月铺好使其熟化，或堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化以消除病虫害。
4种菌根真菌的液体培养物或固体培养物，在用于与金线莲的共生栽培时，可以单独使用，或分别培养后任意选择两种或两种以上共同使用。金线莲苗和菌根真菌按以下方法共生栽培：
(1)地上遮阳栽培：在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培基质厚度5-20cm。栽培时以2-5株金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛金线莲苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛金线莲苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为8-18cm。
(2)立体遮阳栽培：在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培基质厚度3-10cm。栽培时以2-5株金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛金线莲苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛金线莲苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为8-18cm。
金线莲苗与菌根真菌共生栽培后需要的生长条件：环境温度为5-30℃，光照量为正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度为2000-10000lux。在金线莲与菌根真菌共生的过程中每年可以补施液体培养或固体培养的菌根真菌0-5次；
与菌根真菌共生栽培的金线莲，在上述栽培条件下生长6-12个月可以收获，收获时可剪取地上部分，留幼小苗或芽，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干。
具体实施方式
实施例一：
1.开唇兰小菇ma-1的培养
将ma-1自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，转接于pda平皿中，25℃恒温培养10天，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入液体培养基中发酵培养。液体培养基的组成按重量百分含量计算为：葡萄糖2.5％，磷酸二氢钾0.15％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基ph5.6。500ml三角瓶装培养基250ml，高压灭菌后接入mo-1真菌。培养条件为摇床震荡转速120转/分钟，23℃暗培养14天后用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
2.福建金线莲(即花叶开唇兰)苗的培养
福建金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。
金线莲芽分化的培养基是以ms培养基为基本培养基，每升(l)培养基加入蔗糖30g，肌醇100mg，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.0mg，萘乙酸(naa)0.5mg，琼脂9g。培养基ph5.6。100ml玻璃三角瓶装量25ml，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲带有节的茎段。培养条件为23-26℃光照培养100天，光照强度3000lux，光照时间10小时/天。
金线莲丛芽增殖的培养基是以ms培养基为基本培养基，每升(l)培养基加入蔗糖20g，肌醇90mg，6-苄基腺嘌呤(6-ba)1.5mg，吲哚丁酸(iba)0.5mg，玉米素(zt)0.15mg，琼脂10g。培养基ph6.0。100ml玻璃三角瓶装量35ml，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲芽。培养条件为23-26℃光照培养90天，光照强度3000lux，光照时间10小时/天。
壮苗生根培养的培养基是以ms培养基为基本培养基，每升(l)培养基加入蔗糖35g，肌醇120mg，naa2mg，iba1mg，活性炭2g，琼脂9g。培养基ph5.7。100ml玻璃三角瓶装量30ml，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲苗。培养条件为23-26℃光照培养120天，光照强度3000lux，光照时间10小时/天。培养至福建金线莲苗的茎直径0.15cm以上，株高5cm以上，具有4片以上的叶，2条以上长1cm左右的根的壮苗即可进行栽培。
金线莲苗继代的培养基是以1/2ms培养基为基本培养基，每升(l)培养基加入马铃薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，琼脂7.5g。培养基ph5.8。玻璃罐头瓶装量30％，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲的壮苗。培养条件为23-26℃光照培养，光照强度3000lux，光照时间10小时/天。暂时不能移栽的金线莲的壮苗在此培养基上培养。
3.福建金线莲苗与兰小菇ma-1的共生栽培
共生栽培基质选用基质5腐殖土。腐殖土提前1个月左右堆积，并盖塑料布，使其发酵熟化后使用。采用地上遮阳的方法，在玻璃温室中进行栽培。在温室铺一层10-12cm厚的熟化好的腐殖土，栽培时以3-4株福建金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛福建金线莲苗根的基部放置1.5g左右的湿的碎树叶，再在每丛福建金线莲苗的根部放置上述制备好的ma-1真菌液体培养物1.5ml左右，使福建金线莲苗的根部与ma-1真菌培养物接触，最后用腐殖土压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为10cm。
玻璃温室的环境温度控制在18-25℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-500lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金线莲生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
福建金线莲苗与兰小菇ma-1共生栽培后，每隔3个月补施一次液体培养或固体培养的兰小菇ma-1，栽培后9个月收获，收获时一次性连根取出，洗净栽培基质，60℃以下烘干。