本发明涉及一种石斛菌根栽培技术，具体地说涉及一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，它包括本发明所用的菌根真菌、菌根真菌的培养、石斛由原球茎发育至苗及其继代培养、菌根真菌在石斛栽培中的应用技术和对石斛的促生长效果及对有效成分含量的影响。
背景技术：
中华人民共和国药典所收载的石斛为铁皮石斛(dendrobiumcandidum)和金钗石斛(d.nobile)，现商品通称石斛。石斛为我国兰科(orchidacea)传统的名贵药用植物，具有益胃生津、滋阴清热等功效。多年来，由于产区药农的过度采挖，使得这两种植物的自然资源遭到严重破坏，并濒临灭绝，均已被列为国家重点保护的珍稀濒危物种。由于石斛植物种子细小，萌发困难，同时无性繁殖系数低，加上特殊的生活环境，给此类药材大面积栽培带来很大困难。虽然科学工作者及药农采取了组织培养及人工栽培等方法繁殖铁皮石斛和金钗石斛，但组培无菌苗移入自然条件下成活率低、易染杂菌，而人工栽培生长缓慢，难以从根本上解决它们的繁殖困难问题，无法提供大量产品供药用。根据兰科植物与真菌形成菌根结构的特点，我们自1987年开始从事自养型兰科药用植物菌根真菌的分离、培养及其利用菌根真菌在石斛、白芨等药用植物种子萌发方面的研究，并取得了较好效果，自1992年以来对兰科菌根真菌在石斛等兰科药用植物苗生长中进行了应用，我们从野生的铁皮石斛和金钗石斛根中已经分离获得多种内生真菌，并对石斛种子萌发与内生真菌的关系进行了研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种菌根真菌在石斛栽培中的应用技术，可以解决石斛繁殖及成活率低、栽培生长缓慢和周期长、有效成分含量低和药效差等问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养菌根真菌和石斛苗，再将菌根真菌与石斛苗共生栽培。能够完成本发明的菌根真菌是一种小菇属(mycena)真菌，具体为：石斛小菇(mycenadendrobii)，紫萁小菇(mycenaosmundicola)，兰小菇(mycenaorchidicola)，开唇兰小菇(mycenaanoectochila)等4种。上述4种真菌分别可从铁皮石斛、天麻、墨兰和花叶开唇兰获得，这4种真菌于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为0685、0689、0688和0687。
具体地说，本发明所述技术地步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比)：
1、菌根真菌的培养
将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于pda平皿中，于25℃恒温培养12d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体或固体培养基；菌根真菌的液体培养为：
培养基的配制：葡萄糖2.5％；kh2po40.15％；k2hpo40.1％；mgso40.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后分别接入上述真菌。培养条件：培养基ph5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；20℃培养35天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
菌根真菌的固体培养为：
培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-200％。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。
本发明可以采用上述4种菌根真菌中的任选一种，也可以是由其中任意两种或两种以上菌种组成。
2、石斛由原球茎到形成苗及其继代培养
以1/2ms(murashigeandskoog1968)培养基为基本培养基，石斛原球茎增殖时附加萘乙酸(naa)0.2mg/l、吲哚丁酸(iba)0.2mg/l、细胞分裂素(kt)0.2mg/l；原球分化苗时附加iba0.5mg/l，kt0.5mg/l；再生植株生长时附加naa0.5mg/l、iba0.5mg/l、kt0.2mg/l；苗的继代基本培养基为1/2ms培养基，附加180g/l马铃薯提取液，20g/l蔗糖，8g/l琼脂。
3、菌根真菌与石斛苗共生栽培
(1)石斛栽培基质
蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)，以泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2或森林腐殖土∶砂子＝6∶1为佳。
(2)石斛与菌根共生栽培方法
栽培工具各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3cm厚的基质，其上平铺3-5cm厚的小鹅卵石或小碎砖，其逢间用栽培基质填实。株行距各4-8cm栽培3-5株一丛的石斛苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1cm大小的湿栎树(山毛榉科fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌约1.5g。使石斛的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视石斛幼苗的高度而定，一般2-3cm厚。栽后浇放置至室温的水。
(3)栽培条件
塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上，每天光照10h，光照量为正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000lx。
(4)石斛的收获
石斛栽后6-15个月收获，收获时可连根取出洗净栽培基质，阴干或60(c以下烘干。
采用本发明提供的栽培技术，石斛生长周期可由传统栽培的5-7年缩短到1至2年；产量提高20％；与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，本发明使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平。
具体实施方式
实施例一、
1、本实施例采用紫萁小菇(mycenaosmundicola)自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，分别转接于pda平皿中，25℃恒温培养12d时，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入下列培养基。
2、菌根真菌的培养
菌根真菌的液体培养：培养基的配制：葡萄糖2.5％；kh2po40.15％；k2hpo40.1％；mgso40.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后接入上述真菌。
培养条件：培养基ph5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；温度20℃培养35天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
3、石斛原球茎分化及植株生长培养基
石斛为通过组织培养得到的原球茎分化形成的苗，石斛苗株高0.7-1cm。以1/2ms(murashigeandskoog1968)培养基为基本培养基，促进石斛原球茎增殖时附加的最佳激素配比为naa(萘乙酸)0.2mg/l，生长素iba(吲哚丁酸)0.2mg/l，细胞分裂素(kt)0.2mg/l；原球茎分化苗时附加的最佳激素配比为iba0.5mg/l，kt0.5mg/l；再生植株生长时附加的激素配比为naa0.5mg/l，iba0.5mg/l，kt0.2mg/l。
4、石斛苗的准备
石斛为通过组织培养得到的原球茎，之后获得的石斛无菌苗，苗株高1.5-2.5cm。将石斛苗转入有培养基的三角瓶中，基本培养基组成为1/2ms培养基，180g/l马铃薯提取液+20g/l蔗糖，琼脂8g/l，ph6.0。121℃高压灭菌30分钟。每瓶接5-8株苗，培养温度23℃，每日光照10小时，光强为100lx。培养至株高3.5-5.0cm以上的壮苗(50-60天后)即可进行栽培。
5、菌根真菌在石斛栽培中的应用
(1)石斛栽培基质：蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)。
(2)石斛菌根栽培方法
栽培工具为18cm高的各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3cm厚的基质，其上平铺3-5cm厚的小鹅卵石或小碎砖，其逢间用栽培基质填实。株行距各5cm栽培3-5株一丛的石斛苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1cm大小的湿栎树(山毛榉科fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌种1-1.5g。使石斛的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视石斛幼苗的高度而定，一般2-3cm厚。栽后浇放置至室温的自来水即可。
(3)栽培条件
一般塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴均可采用菌根栽培方法栽培石斛。石斛适宜的环境温度为18-23℃，光照量为正常日光量的1/3，最忌夏秋中午前后的直射光，栽培地需架设遮阳网。石斛生长需较高的空气湿度，土壤不宜积水。但其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。每天光照10h，光照量为正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000lx。
(4)石斛的收获
石斛一般栽后6-15个月收获，收获时可连根取出洗净栽培基质，阴干或60(c以下烘干。
实施例二、
本实施例基本操作条件同实施例一，不同之处是：
1、本实施例用的菌根真菌为石斛小菇、紫萁小菇、兰小菇和开唇兰小菇。
2、采用固体培养基，该培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％(重量比)。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。
比较例
菌根真菌对石斛苗的促生长效果
菌根真菌显著促进石斛苗的生长，小菇属菌根真菌促进石斛幼苗生长，接菌栽培的石斛比对照植株节间明显膨大，接菌的石斛的鲜重和干重较不接菌的均有提高，一般提高10％-25％。与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，该项技术使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平。上述结果为在菌根真菌促进石斛苗生长作用基础上，为今后菌根真菌在石斛大规模栽培中应用，保证药材质量提供了科学依据。
从上述可以显然看出，本发明有如下优点：小菇属这4种真菌对石斛的生长发育有明显促进作用；采用该项新技术，石斛生长周期可由传统栽培的5-7年缩短到1至2年；产量提高20％；与不接菌根真菌栽培的石斛苗(对照)相比，该项技术使石斛苗中生物碱等化学成分含量提高至接近野生石斛含量水平，从而保证了菌根共生后石斛药材的质量，为今后菌根真菌应用于石斛规范化栽培提供了科学依据。另外，该技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，生产出的石斛为绿色产品。