一种杂交不育黄姑鱼的生产方法与流程

本发明涉渔业技术领域，具体说是利用人工杂交的方法产生不育黄姑鱼的方法,尤其是涉及一种杂交不育黄姑鱼的生产方法。

背景技术：

性腺不育的鱼类在水产养殖中具有较高的科研和应用价值。首先，性腺不育的鱼类往往表现出生长快、出肉率高等优势；其次，性腺不育的鱼类能够降低因鱼类逃逸到自然界带来的生态风险；再者，性腺不育的鱼类在科研中具有特别的应用，如在鱼类人工“代孕”研究中，性腺不育的鱼类作为受体产生其他鱼种的精子或卵子。因此，探索产生性腺不育鱼类的方法在水产养殖中具有重要意义。

通常，可以通过人工杂交、三倍体诱导、基因敲除（降）等方法产生性腺不育的鱼类。其中，人工杂交作为经典的育种方法之一，由于操作简便而受到研究者的普遍重视。人工杂交是利用不同种间、属间或科间的鱼种进行杂交产生后代。人工杂交成功与否、后代是否能够成活或不育，取决于用于杂交的父母本遗传物质的相容性，杂交的结果往往很难预测。因此，获得完全不育的杂交后代需要大量的试验筛选、验证。我们通过箕作黄姑鱼(Nibea mitsukurii)、黄姑鱼(Nibea albiflora)、银姑鱼 (Pennahia argentata)、日本黄姑鱼(Argyrosomus japonicus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、小黄鱼(Larimichthys polyactis)等进行多个组合的杂交试验，筛选出箕作黄姑鱼和银姑鱼的杂交组合，杂交后代能够完全不育，在养殖生产中具有较好的应用前景，而且能够作为人工“代孕”的受体，具有较高的科研应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有便于现场操作、安全可靠、简单易行，成活率高、抗逆性强、完全不育的利用人工杂交的方法产生性腺不育黄姑鱼的方法。

本发明实现其发明目的所采用的技术方案是：一种杂交不育黄姑鱼的生产方法，该方法包括以下步骤：

（1）亲鱼的培育

选择箕作黄姑鱼雌鱼和银姑鱼雄鱼作为亲鱼，分别对箕作黄姑鱼和银姑鱼进行营养强化和光温调控，促进其性腺同步成熟；培育时采用升温培育，水温由18℃逐渐升到24℃；在亲鱼培育池中挑选性腺发育较好的亲本，挑选后的亲本置于黑布遮住桶中，保持培育水温为22—24℃；

（2）雌性箕作黄姑鱼的人工催产

对雌性箕作黄姑鱼进行催产，选用注射用促黄体素释放激素A2作为催产剂，注射剂量为1kg亲本注射1.5—2μg催产素，亲本的培育温度为24℃时催产效应时间为28—32h；对箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采卵；

（3）人工采集银姑鱼精液

采用人工挤压腹部法采集银姑鱼精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，保存于1.5 mL离心管中，置于冰上；

（4）箕作黄姑鱼♀×银姑鱼♂人工杂交

将箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采集的鱼卵，放入干燥烧杯中；将采集的银姑鱼的新鲜精液滴入未受精的鱼卵中，干法受精，用适量海水激活后搅动使其充分混匀，然后加入2—5倍于卵量体积的海水完成受精过程；

（5）受精卵孵化

将受精卵放入500L玻璃水槽中孵化，水温为24℃，盐度28～32‰，pH8.0～8.2，静水微充气；

（6）杂交苗的培育

受精卵孵化后进行杂交苗的培育，培育分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期，培育水温为20～24℃，盐度28～32‰，pH8.0～8.2，换水量和充气量随鱼苗生长而逐渐增大；苗种培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；

（7）检验杂交苗不育的成功率

待杂交苗培育至3月龄时，解剖取性腺，利用波恩式液固定，采用组织切片观察不育情况。

本发明采用杂交的方法培育不育的黄姑鱼，培育出的黄姑鱼具有成活率高、抗逆性强、完全不育等特点，该方法具有简单易行的优点，培育出的不育黄姑鱼在养殖生产中具有较好的推广应用前景，而且可以作为人工“代孕”的受体，具有非常重要的应用价值。

作为优选，步骤（1）亲鱼的培育中，箕作黄姑鱼和银姑鱼分别养殖于1吨水槽内，每个水槽养殖30—40尾，采用沙滤海水持续微流水，每天投喂1次；水槽覆盖塑料棚保温，水温保持在18℃以上，当水温低于18℃时，采用加热棒加热维持水温在18℃以上；在水槽上方1m处安装1只60W的日光灯，使灯光在培育池的水面分布均匀，光照强度为50～100Lx；亲鱼催产前4周，水温每隔5天升高1℃，逐渐将水温由18℃升至24℃；光强每隔5天增加1小时。

作为优选，步骤（2）雌性箕作黄姑鱼的人工催产中，具体操作为：在雌性箕作黄姑鱼进行催产28h后，对箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采卵，双手在鱼腹部两侧同时均匀用力，自后而前徐徐挤压腹部，使卵子流出，使用500mL 玻璃烧杯接取卵子，将卵放入干燥的烧杯中。

作为优选，步骤（6）杂交苗的培育：仔鱼期的培育，1～15日龄，采用加水培育，每天加水为池水的10%～20%，培育密度2～3万尾/m³，微弱充气，水温保持在24℃；

稚鱼期的培育，15～25日龄，每天加水两次，每次换水量为池水的50%～100%，培育密度0.5～1万尾/m³，每两天吸污1次，培育池水温24℃；

幼鱼期的培育，25日龄后，每天换水一次，换水量100%，培育密度视鱼体大小而定，培育温度为自然海水温度。

作为优选，步骤（4）杂交苗的培育中，鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；投喂方法为：鱼苗1～2日龄不投饵，3～14日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；15～20日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20～25日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，所述轮虫的投喂密度为20～40个/mL，所述卤虫无节幼体的投喂密度为5～15个/mL；26日龄即开始驯化投喂配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后配合饲料的投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定。

作为优选，步骤（7）检验杂交苗不育的成功率中，杂交苗培育至3月龄时，随机抽取30尾，解剖后取性腺，性腺均呈现细线状；将性腺采用波恩式液固定12h后换采用70%酒精保存；将性腺样品脱水、石蜡包埋后进行组织切片，切片后的性腺形态无精小叶或卵巢结构，故鉴定为性腺不育。

本发明的优点和积极效果是：本发明在反复试验的基础上，筛选出箕作黄姑鱼和银姑鱼的杂交组合，杂交后代能够完全不育，从而建立一种大规模培育不育黄姑鱼的方法，该方法具有便于现场操作、安全可靠、简单易行等优点。培育出的不育黄姑鱼在养殖生产中具有较好的推广应用前景，而且可以作为人工“代孕”的受体，具有非常重要的应用价值。

附图说明

图1是本发明中三月龄杂交黄姑鱼的一种结构示意图;

图2是本发明中三月龄杂交黄姑鱼性腺的一种结构示意图;

图3是本发明中杂交黄姑鱼性腺组织切片。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明的技术方案作进一步详细说明。

实施例1：

一种性腺不育黄姑鱼的培育方法，该方法包括以下步骤：

（1）亲鱼的培育

选择箕作黄姑鱼雌鱼和银姑鱼雄鱼作为亲鱼，分别对箕作黄姑鱼和银姑鱼进行营养强化和光温调控，促进其性腺同步成熟；培育时采用升温培育，水温由18℃逐渐升到24℃；在亲鱼培育池中挑选性腺发育较好的亲本，挑选后的亲本置于黑布遮住桶中，保持培育水温为22—24℃；

（2）雌性箕作黄姑鱼的人工催产

对雌性箕作黄姑鱼进行催产，选用注射用促黄体素释放激素A2作为催产剂，注射剂量为1kg亲本注射1.5—2μg催产素，亲本的培育温度为24℃时催产效应时间为28—32h；对箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采卵；

（3）人工采集银姑鱼精液

采用人工挤压腹部法采集银姑鱼精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，保存于1.5 mL离心管中，置于冰上；

（4）箕作黄姑鱼♀×银姑鱼♂人工杂交

将箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采集的鱼卵，放入干燥烧杯中；将采集的银姑鱼的新鲜精液滴入未受精的鱼卵中，干法受精，用适量海水激活后搅动使其充分混匀，然后加入5倍于卵量体积的海水完成受精过程；

（5）受精卵孵化

将受精卵放入100L玻璃水槽中孵化，水温为24℃，盐度28～32‰，pH 8.0～8.2，静水微充气；

（6）杂交苗的培育

受精卵孵化后进行杂交苗的培育，培育分为仔鱼期、稚鱼期、幼鱼期，培育水温为20～24℃，盐度28～32‰，pH8.0～8.2，换水量和充气量随鱼苗生长而逐渐增大；苗种培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料；

（7）检验杂交苗不育的成功率

待杂交苗培育至3月龄时，解剖取性腺，利用波恩式液固定，采用组织切片观察不育情况。

具体操作如下：

（1）箕作黄姑鱼和银姑鱼分别养殖于1吨水槽内，每个水槽养殖30—40尾，采用沙滤海水持续微流水，每天投喂1次。水槽覆盖塑料棚保温，水温保持在18℃以上，当水温低于18℃时，采用加热棒加热维持水温在18℃以上。在水槽上方1m处安装1只60W的日光灯，尽量使灯光在培育池的水面分布均匀，光照强度为50～100Lx。亲鱼催产前4周，水温每隔5d升高1℃，逐渐将水温由18℃升至24℃；光强每隔5d增加1h。

（2）在亲鱼培育池中挑选性腺发育较好的亲本进行人工催产，挑选后的亲本置于黑布遮住的水槽中。选取10尾雌性箕作黄姑鱼进行催产，催产剂选用的是宁波第二激素厂生产的注射用促黄体素释放激素A2，稀释液用复方氨基酸溶液配制，注射剂量为1kg亲本注射1.5-2μg催产素。

（3）催产28h后，对箕作黄姑鱼采用人工挤压腹部法采卵，具体操作为：用海水浸湿的毛巾包裹鱼体，露出腹部生殖孔位置并用脱脂棉将生殖孔及周围擦拭干净，固定好亲鱼后，双手在鱼腹部两侧同时均匀用力，自后而前徐徐挤压腹部，即有卵子流出，使用500mL 玻璃烧杯接取卵子，将卵放入干燥的烧杯中。10尾箕作黄姑鱼有8条获得卵子，催产成功率80%。采用同样的人工挤压腹部法采集银姑鱼精液，用经消毒的干燥玻璃滴管吸取干净精液，保存于1.5 mL离心管中并置于冰上，将精液加入未受精卵中（精液约0.5～1mL），干法受精，轻轻将两者摇动混匀，然后加入5倍于卵量体积的海水完成受精过程。

（4）受精卵孵化

将受精卵放入500L玻璃水槽中孵化，水温为24℃，盐度28～32‰，pH8.0～8.2，静水微充气。

（5）杂交苗的培育

杂交苗的培育过程分为仔鱼期(1～15日龄)、稚鱼期(15～25日龄)和幼鱼期（25日龄以后）。仔鱼期采用加水培育，每天加水为池水的10%~20%，培育密度2~3万尾/m³，微弱充气，水温保持在24℃。

稚鱼期（15～25日龄），每天加是两次，每次换水量为池水的50%~100%，培育密度0.5~1万尾/m3，每两天吸污1次，培育池水温24℃。

幼鱼期（25日龄后），每天换水一次，换水量100%，培育密度视鱼体大小而定，培育温度为自然海水温度。

仔鱼期和稚鱼期培育的盐度均为28～32‰，pH8.0～8.2。

鱼苗培育采用的饵料依次为轮虫、卤虫无节幼体、配合饲料。投喂方法为：鱼苗1~2日龄不投饵，3~14日龄投喂轮虫，初孵仔鱼3日龄开口摄食，开口饵料为褶皱臂尾轮虫，投喂前用高浓度小球藻强化12小时以上；15~20日龄投喂轮虫和卤虫无节幼体，20~25日龄投喂卤虫无节幼体和配合饲料，所述轮虫的投喂密度为20~40个/mL，所述卤虫无节幼体的投喂密度为5~15个/mL；26日龄即开始驯化投喂配合饲料，31日龄完全投喂配合饲料，驯化期采用少量多次的投喂方法，驯化成功后配合饲料的投喂量视鱼苗的消化道饱满程度和观察池底残饵情况决定。

（6）杂交苗培育至3月龄时，随机抽取30尾，解剖后取性腺，性腺均呈现细线状（见图1、图2）。将性腺采用波恩式液固定12h后换采用70%酒精保存。将性腺样品脱水、石蜡包埋后进行组织切片，切片后的性腺形态无精小叶或卵巢结构，故鉴定为性腺不育（见图2）。

该杂交不育黄姑鱼的生产方法，分别以箕作黄姑鱼为母本，银姑鱼为父本，促进其性腺同步成熟；挑选性腺发育良好的箕作黄姑鱼和银姑鱼亲鱼，注射用促黄体素释放激素A2对箕作黄姑鱼进行人工催产；采集箕作黄姑鱼卵子和银姑鱼精子，进行干法受精；杂交仔、稚、幼鱼培育和性腺观察。采用杂交的方法培育性腺不育的黄姑鱼，培育出的黄姑鱼具有成活率高、抗逆性强、完全不育等特点，该方法具有简单易行的优点，培育出的性腺不育的在养殖生产中具有较好的推广应用前景，而且可以作为人工“代孕”的受体，具有非常重要的应用价值。