本发明涉及一种微量植株水溶物化感潜力评价生物测定方法，属生物测定技术领域。
背景技术：
生物间的相生相克现象自古就为人类所认识，并在农业生产中应用以安排作物的轮作倒茬。1996年国际化感协会(International Allelopathy Society)将化感作用定义为：生物个体通过向环境释放化合物影响其周围其他生物生长发育的作用。植物向环境释放化学物质有有机和无机，其形式包括：根系分泌、挥发性气体、淋溶性物质等。植物化感作用是植物对环境适应的一种化学表现形式，植物根、茎、叶等器官或组织向环境释放“化感物质”影响其他植物的作用，也是植物自身防御或抗逆能力的表现形式。
利用植物体在生态系统中的这种自身防御或抗逆能力，可以减少化学农药的使用，减少生产成本投入，降低环境压力，化感潜力的发掘与利用是一种资源节约、环境友好的有害生物控制途径。植物化感作用已成为当今生物科学研究的一个重要方向，也是促进农业可持续发展的重要组成部分。筛选和评价植物化感作用潜力是化感作用研究的第一步，需要采用简单、快速、准确的生物测定方法进行筛选评价。1985年以来，国内外的科学家研究报道了许多化感作用潜力的生物测定方法，如水培测定1、阶梯测试法2、国际水稻研究所的稗草迟播法3、日本科学家的琼脂根箱法4和三明治法5、植株水浸提液法6、7、 澳大利亚科学家的琼脂共培养法8、根系分泌物法9等。其中三明治法、植株水浸提液法以植物地上部分或地下部分等不同组织的水提取液对供试生物生长、发育的影响进行化感潜力评价。植物的根茎叶等不同组织器官是次生代谢物质合成的重要部位，供体植物的次生代谢物/化感物质一般都储存在植物细胞中，以结合态存在，通过生物酶或环境胁迫而分解并从植物的特定部位如根、茎等组织释放出来而产生生物活性。三明治法、植株水浸提液法的测定结果反映了植物体所含有的水溶性物质的生物活性，也代表植物淋溶物质进入环境后对其它植物的影响作用。对于种子来源有限、种子萌发不整齐、培养困难的材料，植株水浸提液法极具优势和不可替代性，并被较广泛应用的化感潜力评价的生测方法，而且具有操作方便、快速、可大批量操作的特点。然而，对于稀有植物、数量少、材料获得有限的情况，水浸提液的方法则不可行，而且如果对大量植株浸提液的无菌处理、储存将增加试验成本，此外，由于不同浓度的水浸提液渗透势差异，对生测结果产生影响10，因此，现有的植株水浸提液生物测定法存在如下缺陷和局限性：(1)不易获得生物材料化感潜力评价，(2)植株水浸提液在环境中易受到微生物影响的技术问题，(3)水浸提液不同浓度渗透势对受体植物生长影响。
本发明是针对不同植物化感作用潜力评价生物测定的需要，根据植物幼苗生长根尖吸收的特性，提供足够的温、光、水条件，排除不同种植物共同生长的种间竞争，既反应植株水溶性物质的生物活性又最大限度控制微生物干扰，通过改进现有的常用的生物测定方法而发明的生物测定方法。
参考文献
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技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种快速、可靠、能大批量操作的微量植株水溶物化感潜力评价生物测定方法。
本发明的微量植株水溶物化感潜力评价生物测定方法，是在现有植株水浸提液化感潜力评价生物测定方法基础上的改进。改进后的微量植株水溶物化感潜力评价生物测定方法，其具体步骤如下:
(1)培养基制备
用水配制以质量分数计的浓度为≥6％的琼脂液，将配制好的琼脂 液在120℃、0.1MPa灭菌20min倒入圆形和方形培养皿中待用；
(2)供体植物A的培养及水浸提液准备
所述的供体植物A种子充分吸水后放在培养皿并置于25℃或28℃的培养室中催芽48小时，然后播种于装入土壤的小盆中，并置于25℃或28℃、12小时光/暗条件的温室种植20-30天，剪取地上部分，用质量分数为3-6％次氯酸钠进行表面消毒5min，然后用无菌水清洗2-3次至无味，用灭菌的吸水纸吸出多余水分，将供体植物A用剪刀剪成1-2cm长的小段，放入无菌容器内，按供体植物A与灭菌水的质量体积比＝1:5-10加入灭菌水封盖，4℃摇床提取24小时，用注射器吸取浸提液，采用0.2μm灭菌过滤膜过滤获得20％-10％的无菌植株水浸提液，4℃冰箱保存备用；
(3)受体植物B的种子表面消毒和萌发
所述的受体植物B的种子表面消毒是用质量分数为3-6％次氯酸钠对受体植物B进行种子表面消毒10min，然后用无菌水清洗2-3次至无味，然后将受体植物B播种于上述1准备的圆形培养皿的培养基中、无菌条件萌发至露白备用；
(4)受体植物B的播种与培养
在上述步骤1中的方形培养皿背面的中部用直尺划线，将步骤3中萌发至露白的受体植物B播种至培养皿中，按培养皿背部所划线整齐播种，每皿15-20粒，封盖后将该培养皿放置在25℃或28℃的培养室内，12小时光/暗培养3-5天，根部向下垂直培养，根生长至0.5-1cm长度最佳，剔除生长不好的植株，每一培养皿中保留10-15 株。
(5)受体植物B的生长量测定值
在上述步骤(2)制备的植株水浸提液中，加无菌水稀释配置成体积百分百比为20％、10％、5％、2.5％浓度的浸提液，用微量移液器取浸提液处理上述步骤4中受体植物B的根尖部分，每植株5-10ul，待处理部位表明无液体则培养皿再次封盖放回培养室培养2-3天，测量受体植物B的主根长度，并以受体植物B的生长量测定值作为生长影响评价的参数；
(6)对照处理
将上述步骤(4)受体植物B的根尖采用无菌水代替植株水浸提液处理，处理方法、培养条件和时间同上述步骤(5)所述；从培养皿中取出受体植物B测量主根长度，并以对照的生长量测定值作为生长影响评价的参数；
(7)植物浸提液化感潜力的计算
植物浸提液化感潜力的计算公式为IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示受体植物B的生长量测定值，ck表示对照植物的生长量测定值，IR表示供体植物A对受体植物B的影响作用，当IR＜0时，表示供体植物A对受体植物B的作用为刺激生长；当IR＞0时，表示供体植物A对受体植物B具有抑制作用；当IR＝0时，表示供体植物A对受体植物B没有活性或表示两种植物间无化感作用存在。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、采用6％的琼脂水溶液，作为一种介质其状态接近固体能够垂 直放置，有利于受体植物在其表面生长，同时提供供植物生长需要的水分和方便处理操作；
2、所有操作在无菌条件下，植株水浸提液也采用0.2μm灭菌过滤膜进行过滤灭菌，最大限度地控制了微生物的污染以及微生物对化感物质的分解作用；
3、根据植物幼苗生长根系吸收的特性，采用供体植物浸提液微量处理受体植物根尖，对供体植物的需要量极少，又充分反应供体植物提取液对受体的作用，同时免除了植株水浸提液法测定中需要进行渗透压调节的过程。
4、排除了植物浸提液需要较大量的供体植物组织，直接反应植物体水溶性物质对其他生物的影响作用，具有微量准确的特点，非常适于实验室的植物种质资源的大量筛选评价工作。
5、是一种有效、经济、快速、准确、能大批量操作的的实验室植物淋溶物化感潜力评价方法。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
试验材料为水稻和稗草，其中水稻是供体植物分别采用以下5个品种：已报道的非化感品种Lemont、已报道的化感品种PI312777、Koukesumochi、Dongjingbyeo和K21；受体植物为稗草。试验重复3次。
本实施例步骤如下：
1、培养基制备，用水配制以质量分数计的浓度为6％的琼脂培养基，120℃、0.1MPa灭菌20min后分别倒入圆形和方形培养皿中待用；
2、供体植物为上述提及的5种水稻，将水稻种子充分吸水后放在培养皿并置于28℃的培养箱中催芽48小时，然后播种于装入土壤的小盆中，并置于28℃、12小时光/暗条件的温室种植20天，剪水稻地上部分，用质量分数为3％次氯酸钠对水稻地上部分进行表面消毒5min，然后用无菌水清洗3次，用灭菌的吸水纸吸出多余水分，用剪刀剪成1cm或2cm长的小段，放入经灭菌的10ml试管中，1g水稻材料加入5ml灭菌蒸馏水，封口，4℃浸提24小时后用注射器吸取浸提液，采用0.2μm灭菌过滤膜过滤灭菌后获得的含量为20％的植株水浸提液，4℃冰箱保存备用；
3、受体植物为稗草，将稗草种子用质量分数为6％次氯酸钠表面消毒，灭菌水清洗后均匀播种在上述1准备的圆形培养皿中，无菌条件萌发至露白；
4、在步骤1的方形培养皿背面中部用直尺划线，步骤3中萌发至露白的稗草播种在培养皿中，按培养皿背部所划线整齐排列，根部向下，每皿20粒，封盖后将该培养皿放置在28℃的培养室内，12小时光/暗垂直培养3天，剔除生长不好的植株，保留主根长0.5-1cm长的植株，每一培养皿留15株稗草；
5、将步骤2制备的植株水浸提液，加无菌水稀释而配置成体积百分比为20％、10％、5％三个浓度梯度的浸提液，用微量移液器取 浸提液分别处理步骤4的受体植物稗草的根尖部分，每植株10ul，待处理部位干后将培养皿再次封盖放回培养室培养3天，测量稗草的主根长度，以稗草的主根长度测量值作为生长影响评价的参数；
6、植物浸提液化感潜力的计算，植物浸提液化感潜力的计算公式为IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示处理组受体植物稗草的生长量测定值，ck表示对照组稗草的生长量测定值，IR表示供体植物水稻对受体植物稗草的影响作用，当IR＜0时，表示供体植物水稻对受体植物稗草的作用为刺激生长；当IR＞0时，表示供体植物水稻对受体植物稗草具有抑制作用；当IR＝0时，表示供体植物水稻对受体植物稗草没有活性或表示两种植物间无化感作用存在。
表1本发明方法中水稻浸提液对稗草的化感潜力评价结果
实施例2：
试验材料为水稻和莴苣，其中水稻是供体植物分别采用以下3个品种：已报道的非化感品种Lemont、已报道的化感品种PI312777和Koukesumochi；受体植物为莴苣。试验重复3次。
本实施例步骤如下：
1、培养基制备，用水配制以质量分数计的浓度为6％的琼脂培养基，普通高压灭菌后分别倒入圆形和方形培养皿中待用；
2、供体植物为上述提及的3种水稻，将水稻种子充分吸水后放在培养皿并置于25℃的培养箱中催芽48小时，然后播种于装入土壤的小盆中，并置于25℃、12小时光/暗条件的温室种植30天，剪水稻地上部分，用质量分数为6％次氯酸钠对不同品种水稻地上部分进行表面消毒5min，然后用无菌水清洗3次，用灭菌的吸水纸吸出多余水分，用剪刀剪成1cm或2cm长的小段，放入经灭菌的10ml试管中，1g水稻材料加入5ml灭菌蒸馏水，封口，4℃浸提24小时后用注射器吸取浸提液，采用0.2μm灭菌过滤膜过滤灭菌后获得的含量为20％的植株水浸提液，4℃冰箱保存备用；
3、受体植物为莴苣，用质量分数为3％次氯酸钠将莴苣种子进行表面消毒，灭菌水清洗至无味后均匀播种在上述1准备的圆形培养皿中无菌条件下萌发出芽；
4、在步骤1的方形培养皿背面中部用直尺划线，步骤3中已萌发莴苣播种在培养皿中，按培养皿背部所划线整齐排列，根部向下，每皿15粒，封盖后将该培养皿放置在25℃的培养室内，12小时光/暗垂直培养2天，剔除生长不好的植株，每一培养皿中保留根长0.5-1.0cm的莴苣10株；
5、将步骤2制备的植株水浸提液，加无菌水稀释而配置成体积百分比为10％、5％、2.5％三个浓度梯度的浸提液，用微量移液器取浸提液分别处理步骤4的受体植物莴苣根尖部分，每植株5ul，待处 理部位干后培养皿再次封盖放回培养室培养2天，测量莴苣的主根长度，以莴苣的主根长度测量值作为生长影响评价的参数；
6、植物浸提液化感潜力的计算，植物浸提液化感潜力的计算公式为IR＝(1-Tr/ck)×100，其中Tr表示处理组莴苣的生长量测定值，ck表示对照组莴苣的生长量测定值，IR表示供体植物水稻对莴苣的影响作用，当IR＜0时，表示供体植物水稻对受体植物莴苣的作用为刺激生长；当IR＞0时，表示供体植物水稻对受体植物莴苣具有抑制作用；当IR＝0时，表示供体植物水稻对受体植物莴苣没有活性或表示两种植物间无化感作用存在。
表2本发明方法中水稻浸提液对莴苣的化感潜力评价结果
发明人将本发明方法中水稻浸提液对受体植物稗草、莴苣的抑制作用结果与现有植株水浸提液法(供体植物同实施例1，受体材料为莴苣)的化感潜力评价结果(见表3)相比较，得出如下结果：
表3水稻水浸提液法对莴苣化感潜力评价结果
植株水浸提液法与本发明方法的测定结果具有较高的一致性。植株水浸提液法提取液采用普通过滤，不同浓度的水浸提液进行受体材料培养前需要调节渗透势为一致，以排除对受体植物生长的影响，此外这种方法在培养过程中也极易受微生物污染而干扰、影响测定结果。
本发明采用6％的琼脂作为培养基质，为供体植物种子萌发、生长提供了足够的水分，有助于植物的生长；培养皿垂直放置可以使植物生长在培养基的表面，方便处理操作。本发明所有操作在无菌条件下进行，最大限度地控制了微生物的干扰以及微生物可能对化感物质的分解作用。此外，由于直接处理受体植物生长点(根尖)，所需要的水浸提液的量极少，既简化了操作提高效率又节约成本。