一种长臀鮠精液超低温保存方法及其稀释液与流程

本发明属于水产养殖技术领域。更具体地，涉及一种名贵易危鱼类长臀鮠的精液超低温保存方法及其稀释液。

背景技术：

长臀鮠是鲇形目，长臀鮠科，长臀鮠属鱼类。体长，侧扁，背鳍起点为体最高处。头平扁，略呈三角形，背面骨粗糙裸露。吻突出，钝圆。口近端位，弧形，上颌略突出。为亚热带山麓河溪底层鱼类，喜清澈流水环境。长臀鮠无肌间刺，肉味鲜美，营养价值高，所以市面上价格较高，经常出现供不应求的状况。野生长臀鮠由于过度捕捞，导致其野生资源和苗种的匮乏（导致种苗等野生资源十分匮乏）。同时，长臀鮠是珠江流域最名贵、人工繁育难度最大的名优经济鱼类之一。纵然国内部分学者长期致力于长臀鮠的人工繁殖学，受精生物学的基础研究，力求找到影响长臀鮠人工受精苗种受精率存活率的关键因素，但效果甚微。

我们课题组在珠江长臀鮠初步人工繁殖成功的基础上，发现制约长臀鮠人工繁殖的主要因素不是水温、ph等传统环境生态因子，也不是雌性亲鱼卵质不好，问题可能出在雄亲鱼身上，与雄亲鱼的性腺发育状态有关，而发育较好的雄亲鱼很难获得，即使偶尔获得了发育较好的雄亲鱼，但雌亲鱼也可能没有发育成熟，这种雌雄发育不同步的现象是长臀鮠人工繁殖不能成功的瓶颈问题。因此，对长臀鮠雄性亲鱼精液的保存是至关重要的，目前尚未见有相关的研究和报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有长臀鮠精液保存技术的不足，提供一种长臀鮠精液稀释液和超低温保存方法，为其种质研究及遗传管理、精液冷冻保存及种质保护等提供保障，对解决长臀鮠人工繁殖技术难题、保护长臀鮠资源及实现我国名优鱼类养殖业的健康可持续发展提供重要的科学指导。

本发明的目的是提供一种长臀鮠精液保存稀释液。

本发明另一目的是提供一种长臀鮠精液超低温保存方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种长臀鮠精液保存稀释液，由糖、钠盐、钾盐、钙盐、酪氨酸、甘氨酸、蒸馏水和抗冻剂组成；所述抗冻剂为二甲基亚砜。

其中，优选地，所述糖为葡萄糖，或所述糖为葡萄糖和果糖。

优选地，所述钠盐为nacl、nahco3或na2hpo4中的一种或几种。

优选地，所述钾盐为kcl，或所述钾盐为kcl和kh2po4。

优选地，所述钙盐为cacl2。

优选地，所述长臀鮠精液保存稀释液还包含有镁盐；优选地，所述镁盐为mgcl2或mgso4。

本发明的长臀鮠精液保存稀释液使用前加入硫酸新霉素和链霉素。优选地，硫酸新霉素和链霉素的加入体积比均为1～1.2：1。

具体优选地，本发明所述长臀鮠精液保存稀释液有以下a、b、c三种配方：

a配方：每100ml蒸馏水中含有0.15～0.2g葡萄糖、1.5～1.6gnacl、0.15～0.18gkcl、0.02～0.03gcacl2、0.04～0.05gmgso4·7h2o、0.06～0.07gnahco3、0.03～0.04gna2hpo4·h2o、0.01～0.015gkh2po4、0.18～0.2gc6h12o6·h2o，终体积浓度为5%～15%的二甲基亚砜；

b配方：每100ml蒸馏水中含有1.5～2g葡萄糖、1～1.5g果糖、0.05～0.1gkcl、0.01～0.03gcacl2、0.18～0.25gnahco3，终体积浓度为5%～15%的二甲基亚砜；

c配方：每100ml蒸馏水中含有2.5～3g葡萄糖、0.8～1gnacl、0.1～0.2gkcl、0.02～0.04gcacl2、0.01～0.02gmgcl2·6h2o、0.05～0.08gna2hpo4、0.3～0.4gnahco3、0.1～0.2g酪氨酸、0.05～0.1g甘氨酸，终体积浓度为5%～15%的二甲基亚砜。

更优选地，所述长臀鮠精液保存稀释液的a、b、c三种配方如下：

a配方：每100ml蒸馏水中含有0.18g葡萄糖、1.52gnacl、0.168gkcl、0.028gcacl2、0.0472gmgso4·7h2o、0.065gnahco3、0.035gna2hpo4·h2o、0.012gkh2po4、0.188gc6h12o6·h2o，终体积浓度为10%的二甲基亚砜；

b配方：每100ml蒸馏水中含有1.8g葡萄糖、1.2g果糖、0.08gkcl、0.02gcacl2、0.21gnahco3，终体积浓度为10%的二甲基亚砜；

c配方：每100ml蒸馏水中含有2.68g葡萄糖、0.98gnacl、0.16gkcl、0.03gcacl2、0.012gmgcl2·6h2o、0.06gna2hpo4、0.32gnahco3、0.12g酪氨酸、0.08g甘氨酸，终体积浓度为10%的二甲基亚砜。

以上精子保存液均用可密封棕色玻璃瓶低温保存备用。

以上三种精液保存稀释液配方中，尤以c配方的效果最显著。

另外，一种长臀鮠精液的超低温保存方法，包括如下步骤：

s1.鱼种选择：选择无疾病、性成熟特征明显的雄性亲鱼；

s2.配制精液保存稀释液；

s3.采集精液：对步骤s1的雄性亲鱼进行精液采集；

s4.精液超低温保存：将步骤s2的精液保存稀释液中加入硫酸新霉素和链霉素后，按照精液：保存稀释液=1：5～6的体积比，将s3采集的精液保存在保存稀释液中；然后采用-10～-11℃/30s的降温速率，在到达-150℃后，放入液氮中进行超低温保存；

s5.解冻复苏：取出超低温保存的长臀鮠精液，加入解冻液，放入32℃～40℃的水浴中快速解冻复苏；所述解冻液为体积分数0.65%～0.7%的pbs缓冲液。

其中，优选地，步骤s1所述鱼种选择具体是：先选育出外形无伤病、年龄较大（成熟期），个体较重（3斤以上）的个体进行强化培育；然后选择体质强壮健康、体表无损伤、无充血、腹胀、烂鳍、突眼等病症，且性成熟特征明显、体质健壮、形态端正、游姿平稳、体色鲜艳的雄性亲鱼采集精液。此法对后期的精液保存极其重要。

优选地，步骤s3采集精液的具体方法可以参考如下：采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，使用ms-222麻醉剂对亲鱼进行麻醉后，于无菌操作台上迅速取出精巢，称重，用剪刀将精巢彻底剪碎使精子充分释放，收集得精子悬液。以上全过程均在冰上操作，精子悬液中包含精子、精细胞、精浆、血细胞及微小组织碎片等。

优选地，步骤s4所述硫酸新霉素或链霉素：保存稀释液的体积比均为1～1.2：1。

优选地，步骤s4所述降温速率为-10.5℃/30s。

优选地，步骤s4中使用的容器为塑料离心管，即将步骤s2的精液保存稀释液加入塑料离心管中，再加入硫酸新霉素和链霉素，按照精液：保存稀释液=1：5～6的体积比，将s3采集的精液加入塑料离心管；然后采用-10.5℃/30s的下降速率，在到达-150℃低温后，将塑料离心管直接浸入液氮中进行超低温保存。

优选地，步骤s5所述解冻复苏的温度为36℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的长臀鮠精液稀释液和超低温保存及复苏方法，能够保证长臀鮠精液保存时间的持久性，精液超低温保存技术极大的促进了长臀鮠种质资源开发与育种改良，在长臀鮠养殖中有着重大的理论和现实意义。首先，通过建立优良养殖长臀鮠的冷冻精子库，可将优良长臀鮠的原良种进行长期保存，从而避免因过渡捕捞、环境污染及生态破坏而造成的长臀鮠物种灭绝或生产上长期养殖和近亲交配导致种质资源退化和变异现象；其次，通过精子超低温保存，可使性腺发育和生殖期不同步、性逆转及地理隔离的养殖品系得以交配，恢复种质资源和自然保存量，而且可进一步产业化和规模化生产，具有十分可观的生态经济和社会效益。

具体地，本发明的技术方案具有以下显著的创新和意义：

1、改进采样方法：以珠江名贵易危的长臀鮠为发明对象，采集不同地理种群的野生的长臀鮠亲鱼，利用精液超低温保存技术初步解决了雌雄性腺发育不同步的问题。

2、改良保存稀释液配方：根据长臀鮠的生物学和性腺特征以及不同稀释液配方保存后精子的成活率高低，对长臀鮠精子保存稀释液配方作了进一步的改良，并选取了3个优良配方，效果均良好，尤以c配方效果显著。

3、改进精液保护剂：精子保护剂采用一定比例的硫酸新霉素和链霉素复合剂，取代了单纯的青霉素，对精子起到了较好的保护作用。精子抗冻剂浓度的摸索，我们发现添加10%二甲基亚砜对超低温保存的精子效果最好。

4、优化降温法：超低温保存使用逐级快速降温法，在前人基础上作了较大的改进，对精子的保存效果具有积极的意义。

5、改良冻精解冻液：长臀鮠冻精解冻液用体积分数0.65%～0.7%的pbs缓冲液，取代了生理盐水或蒸馏水，对精液的保护效果更好。

附图说明

图1为精液的percoll分离结果示意图。

图2为精液的3层percoll不连续梯度分离结果。

图3为长臀鮠精子超低温冷冻保存30d后精子运动率及存活率结果。

图4为不同复苏温度对精子活力的影响。

图5为显微镜16×10倍数下观察复苏后精子情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1长臀鮠的精液保存稀释液

1、精子保存液稀释a配方：分别配制甲液和乙液，根据我们的摸索和实验，甲液最佳配方为：葡萄糖1.80g，nacl15.2g，kcl1.68g，cacl20.28g，mgso4·7h2o0.472g，最后加入100ml的蒸馏水溶解；

乙液配方为nahco30.65g，na2hpo4·h2o0.35g，kh2po40.12g，c6h12o6·h2o1.88g，最后加入100ml的蒸馏水溶解。

取甲液、乙液各10ml，混合后加蒸馏水定容至100ml，并加入终体积浓度为5%、10%或15%的二甲基亚砜，即配制成精子保存稀释液a。

2、精子保存稀释液b配方：葡萄糖1.80g，果糖1.2g，kcl0.08g，cacl20.02g，nahco30.21g，蒸馏水100ml，并加入终体积浓度为5%、10%或15%的二甲基亚砜。

3、精子保存稀释液c配方：葡萄糖2.68g，nacl0.98g，kcl0.16g，cacl20.03g，mgcl2·6h2o0.012g，na2hpo40.06g，nahco30.32g，酪氨酸0.12g，甘氨酸0.08g，蒸馏水100ml，并加入终体积浓度为5%、10%或15%的二甲基亚砜。

经过试验验证，上述3个优良配方保存后精子的成活率均较好，尤以c配方效果最显著。二甲基亚砜的体积浓度以10%的效果最好。

实施例2长臀鮠的精液超低温保存方法

本发明提供了长臀鮠的精液超低温保存方法，主要步骤如下：鱼种选择、精子保存稀释液和抗冻剂配制、精子采集与品质观察、精液超低温保存、解冻复苏、精子活力观察。具体的操作方法如下：

1、鱼种选择

自然环境的鱼种采集是长臀鮠重要的亲鱼来源，通过长期的野外调研，我们引进采集长臀鮠亲鱼300多尾，其中选育出外形无伤病、年龄较大，个体较重的3斤以上个体100多尾，在清远市兴渔水产科技有限公司科研示范基地进行强化培育。在采集精液时选择体质强壮健康，体表无损伤，无充血、腹胀、烂鳍、突眼等病症，且性成熟特征明显、体质健壮、形态端正、游姿平稳、体色鲜艳的雄性亲鱼。此法对后期的精液保存极其重要。

2、精子保存稀释液配制

按照实施例1，配制精子保存稀释液。

3、精子采集、分离与品质观察

（1）精子采集选用10ml可密封避光离心管，经灭菌处理后作为精子保存容器，共60个，每种保存液20个，将保存液小心的加入到离心管中，并分别按照1～1.2：1的比例加入硫酸新霉素和链霉素，对照组不加硫酸新霉素和链霉素，并编好号。

采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，使用ms-222麻醉剂对亲鱼进行麻醉后，于无菌操作台上迅速取出精巢，称重，用剪刀将精巢彻底剪碎使精子充分释放。分别将收集得的精子悬液通过沙绢网过滤并做好标记。

以上全过程均在冰上操作，精子悬液中包含精子、精细胞、精浆、血细胞及微小组织碎片等。等渗的100%percoll溶液以percoll(pharmacia,uppsala,sweden)原液及10×pbs按9：1的比例混匀而成。随后的percoll梯度则按实验需求通过1×pbs进行稀释（10%～90%），此过程使用三种规格的无菌离心管。

（2）采集结束后进行镜检，取2µl精液在显微镜下进行观察，精子的活力为：大约有82%可作快速直线前进运动，9%作微弱的曲线运动或摆动，6%原地打转，3%不动，精子活率为0.82。

进一步利用计算机精子辅助分析仪检测显示，新鲜精液的ph值为7.1。

长臀鮠精子percoll分离结果如附图1所示，3层percoll不连续梯度分离结果如图2所示。

4、精液低温和超低温保存

（1）将精子分成两部分，一部分精子用于低温保存实验，另一半精子用于超低温保存实验。冷冻方法采用塑料离心管冷冻法，具有冷冻量大、操作简便、安全性高等特点，可用于精液冷冻保存和精子库建立。

取出精液，测量精液体积量，等体积置于离心管，精液与保存液比例为1：5～6，此法简便、成本低廉，适合在生产上推广应用。

（2）具体地，我们对精子进行了低温保存实验，精子4℃低温保存结果如下表1所示：

表1精液4℃低温保存结果

注：“++”表示80～90%以上的精子快速运动；“+”表示50～60%精子快速运动；“+－”表示20～30%精子快速运动；“－”表示全部死亡或少量在原地振动。

我们发现，过快或过慢的冷却速率均会导致细胞损伤，降低长臀鮠精子的存活率。因此，我们将采集的精液采用逐级快速降温法进行低温保存，我们针对长臀鮠的精子，具体方法是采用-10.5℃/30s的下降速率，在到达-150℃低温后，直接浸入液氮中，此法效果较好，可以最大限度的保护精子，每种精子保存液分3组保存观察。我们的具体做法是将长臀鮠精子超低温冻存30天后取出解冻，解冻后发现添加5%二甲亚砜与10%二甲亚砜对冷冻保存的精子运动率影响差异不显著（37.6%和36.2%）但都显著高于15%二甲亚砜组（24.4%），但通过精子存活率来看，10%二甲亚砜保持46.6%显著高于5%二甲亚砜组的37.2%（如图3）。综上所述，添加10%二甲基亚砜作为抗冻剂效果最好。

5、解冻复苏

解冻复苏是精子升温溶解复苏的过程，也是精子恢复活力的过程，解冻的关键因素是解冻液和解冻速度。

经过我们反复的试验和摸索，长臀鮠冻精解冻液用体积分数0.65%～0.7%的pbs缓冲液效果较好。

解冻速度采用的是快速解冻法，具体操作是在32℃～40℃的水浴锅中快速解冻。本方法与快速冷冻的过程相对应，起到了很好的效果。

我们比对分析了不同复苏温度对解冻后长臀鮠精子活力的影响发现，复苏温度为36℃时，复苏后的精子活力最高，为30.66%。具体不同复苏温度对精子活力的影响如图4所示。

6、精子活力观察

保存效果评价以精子被激活后的活力(快速运动精子占总精子数的百分比)作为指标。先将精子保存液取出摇匀，然后快速用移液枪吸出一小滴置于载玻片上，在显微镜16×10倍数下观察精子，观察到精子后立即用半滴蒸馏水激活，观察其运动情况并记录。我们发现，视野中作直线前进运动的精子的百分比为45%以上，在原地颤动、摆动或作微弱曲线运动的精子35%左右，完全不动的精子少于20%，这些精子无受精能力（显微镜16×10倍数下观察精子情况如图5所示）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。