本发明涉及一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法。属于植物组织培养技术领域。
背景技术：
建兰（学名：cymbidiumensifolium(l.)sw.）为地生植物，又名雄兰、骏河兰、剑蕙等，也称秋兰，假鳞茎卵球形，包藏于叶基之内，主花形成通常在金秋季节，花常有香气，色泽变化较大，通常为浅黄绿色而具紫斑。其繁殖方法一般为分株繁殖，3～4年才能进行一次，繁殖速度较慢。建兰种子非常细小、呈粉状，没有胚乳，只有一个简单的胚，外面包着疏松、透明、不易透水的种皮，胚内含有很少的营养物质，绝大部分为脂类物质，自然条件下建兰种子很难萌发。因此，传统的种子保存技术不适用建兰种质资源保存。
建兰多数栽培品种均是由野生种驯化或自然变异筛选而来。从资源上来说，由于对野生国兰资源的大量采挖，天然资源已遭到了大量破坏，可采集的野生资源越来越少，再加上自身繁殖速度极其缓慢，我国野生建兰资源日趋紧缺，有些珍稀品种已濒临灭绝，因此，建立科学、有效、实用的建兰种质资源保存技术迫在敏捷。通过有计划的培育、繁殖、发展、保存濒危的特有种类，才能避免该物种灭绝。
组织培养作为植物种质资源离体保存技术已被广泛使用，在种质资源交换过程中，利用试管苗进行交换不仅运输成本低，还可避免在交换过程中病虫害的传播，也可以解决大田保存占地面积大、费用高等问题。频繁的离体继代培养保存技术，在每一次继代培养过程中都有可能造成交叉污染，多次的继代培养还会引发遗传变异，同时，随着继代培养数量的增加要耗费大量的人力物力。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种建兰种质资源离体保存方法。
本发明还提供了所述离体保存方法保存后恢复生长的方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种建兰种质资源离体保存方法，从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于vw培养基辅以0.5～1mg/l6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎，将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为vw培养基辅以0.2～0.4mg/l6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎，然后采用vw培养基辅以2.5mg/l多效唑（pp333）的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在0～5℃条件下暗培养。
优选的，所述茎尖的剥取方法如下：选择长度为5～7cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的1～2个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗3～4秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗3～4次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。
优选的，将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。
优选的，原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。
优选的，反复切割和继代培养的具体方法是：将生长为4～6mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。
优选的，所述发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。
优选的，暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。
优选的，暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好，以减少离体保存培养基中水分的挥发。
进一步优选的，试管或培养瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外层缠绕3层塑料保鲜薄膜。
上述离体保存方法保存后恢复生长的方法，将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。
优选的，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第2～3片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有2～3条根，5～6片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。
本发明的有益效果：
本发明是利用建兰茎尖培养技术，诱导出原球茎，然后通过原球茎分化获得建兰幼苗。作为继代培养过程中的原球茎，是分化幼苗的中间体，通过低温保存原球茎，在离体保存培养基中添加适量多效唑，可以大大延长保存时间，减少继代培养次数，有效保持了种质资源的遗传特性。保存一定时间后，将培养物置于正常温度和光照条件下培养，能迅速恢复生长，分化出幼苗。
现有技术中通常采用的种子萌发及快速繁殖技术，虽然能获得大量植株，但繁殖后代变异系数较大，遗传稳定性和品种一致性存在问题，不符合种质资源的保存条件。本发明采用茎尖培养作为外植体，茎尖是植物中生长最快的分生组织，遗传基因稳定，再生能力强，基本不含病毒和其他病源组织（如细菌、真菌等），经过组织培养后可以得到遗传稳定、品种一致以及健壮的无病毒、无病菌植株，达到了去病菌和快速繁殖的目的，具备了种质资源离体保存的必要条件。
一般种质资源离体保存技术大都采用试管幼苗保存，但试管幼苗对温度反应比较敏感，保存温度基本都在12℃以上，不利于较低温度保存。除建兰植物之外，其他植物诱导、分化试管苗的中间体大多为愈伤组织，将愈伤组织诱导成胚状体或不定芽，最终分化生产出试管苗，而愈伤组织诱导率一般比较低，恢复培养后在继续分化出试管苗的比例也较低，相对于建兰原球茎90%以上的分化率，保存愈伤组织需要较高的成本。
本发明采用原球茎进行离体培养保存，原球茎对温度的敏感性大大降低，可以有效降低保存温度，温度越低，生长速度就越缓慢，保存时间就越长，原球茎在温度0～5℃范围内可以缓慢生长；保存设施也相对简单，在低温冰柜中采用暗培养保存技术，去掉了光照设施，控温也相对容易，减少了光能损耗，降低了电能消耗，有效的降低保存成本；在离体保存培养基中辅以多效唑，多效唑为植物生长延缓剂，通过抑制赤霉素的合成，减少细胞的分裂和伸长，降低生长速度，减少了对培养成分的消耗，延长离体培养物的保存时间，保存时间可达到40个月以上。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：
一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，具体步骤如下：
（1）从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于vw培养基辅以0.5mg/l6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎。
其中，茎尖的剥取方法如下：选择长度为5cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的1个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗3秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗3次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。
将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。
原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。表1示出了不同的6-苄基腺嘌呤浓度对原球茎形成的影响。
表1.6-苄基腺嘌呤含量对原球茎形成的影响
（2）将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为vw培养基辅以0.2mg/l6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎。
具体方法是：将生长为4mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。
（3）采用vw培养基辅以2.5mg/l多效唑的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在0℃条件下暗培养。
其中，发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。
暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。
暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好（试管或培养瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外层缠绕3层塑料保鲜薄膜），以减少离体保存培养基中水分的挥发。
（4）保存后恢复生长：将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。
其中，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第2片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有2条根，5片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。
实施例1涉及的各培养基如下：原球茎诱导培养基（vw培养基辅以0.5mg/l6-苄基腺嘌呤）、继代培养基（vw培养基辅以0.2mg/l6-苄基腺嘌呤）、离体保存培养基（vw培养基辅以2.5mg/l多效唑）、分化培养基（kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁）。
实施例2：
一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，具体步骤如下：
（1）从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于vw培养基辅以1mg/l6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎。
其中，茎尖的剥取方法如下：选择长度为7cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的2个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗4秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗4次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。
将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。
原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。
（2）将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为vw培养基辅以0.4mg/l6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎。
具体方法是：将生长为6mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。
（3）采用vw培养基辅以2.5mg/l多效唑的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在5℃条件下暗培养。
其中，发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。
暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。
暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好（试管或培养瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外层缠绕3层塑料保鲜薄膜），以减少离体保存培养基中水分的挥发。
（4）保存后恢复生长：将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。
其中，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第3片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有3条根，6片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。
实施例2涉及的各培养基如下：原球茎诱导培养基（vw培养基辅以1mg/l6-苄基腺嘌呤）、继代培养基（vw培养基辅以0.4mg/l6-苄基腺嘌呤）、离体保存培养基（vw培养基辅以2.5mg/l多效唑）、分化培养基（kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁）的具体配方见表2。
实施例3：
一种建兰种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法，具体步骤如下：
（1）从建兰新生长的假鳞茎上剥取茎尖，将其置于vw培养基辅以0.8mg/l6-苄基腺嘌呤的原球茎诱导培养基表面培养成原球茎。
其中，茎尖的剥取方法如下：选择长度为6cm的假鳞茎，用自来水清洗表面尘土，剥去最外层的1个叶片，用体积浓度75%的酒精擦洗4秒，放入质量浓度0.1%的升汞溶液中灭菌20分钟，无菌水冲洗3次，晾干或用滤纸吸干表面水分，在显微镜下剥取大小约为0.5mm的茎尖。
将茎尖置于试管或培养瓶中原球茎诱导培养基的表面，轻压茎尖以接触到原球茎诱导培养基的表面为宜，避免埋入，进而引起窒息死亡，及时密封并做好标记。
原球茎的培养方法是：将茎尖在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养15天后，出现明显膨大，30天后出现若干个白色突起，45天后，所述突起体积增大形成原球茎。
（2）将原球茎进行反复切割和继代培养，所采用的继代培养基为vw培养基辅以0.3mg/l6-苄基腺嘌呤，从而繁殖出所需数量的原球茎。
具体方法是：将生长为5mg的原球茎切割成4块，然后置于继代培养基中继续扩增培养，建立无性繁殖系，反复切割和继代培养，从而短时间繁殖出所需数量的原球茎。
（3）采用vw培养基辅以2.5mg/l多效唑的离体保存培养基进行培养，待原球茎进入发育生长阶段后，在2℃条件下暗培养。
其中，发育生长阶段是选择发育健壮、大小均匀的原球茎，置于离体保存培养基中，在25℃，光照2000lux，每天光照10小时的条件下培养7天。
暗培养阶段应当定期观察生长情况，随时剔除有污染的培养瓶。
暗培养阶段所使用的离体保存培养基，厚度约为4cm，并且，用于放置离体保存培养基的试管或培养瓶应当密闭良好（试管或培养瓶以封口膜密封，并且，在封口膜的外层缠绕3层塑料保鲜薄膜），以减少离体保存培养基中水分的挥发。
（4）保存后恢复生长：将暗培养中的原球茎转移至分化培养基上，由原球茎分化产生幼苗；所述分化培养基为kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁，培养温度25℃，光照强度2000lux，每天光照时间为10小时。
其中，原球茎在分化培养基上接种30天后，在原球茎顶端部分出现由叶原基发育成的幼叶，随后幼叶迅速生长，待出现第3片叶时，原球茎向下伸长，并且有第1条根生出；50天后，等到幼苗有2条根，5片叶，生长到10cm左右，发育成完整的植株，将试管苗移栽在育苗基质中，在自然条件下生长成正常植株。
实施例3涉及的各培养基如下：原球茎诱导培养基（vw培养基辅以0.8mg/l6-苄基腺嘌呤）、继代培养基（vw培养基辅以0.3mg/l6-苄基腺嘌呤）、离体保存培养基（vw培养基辅以2.5mg/l多效唑）、分化培养基（kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁）。
实施例1～3涉及的原球茎诱导培养基（vw培养基辅以0.5～1mg/l6-苄基腺嘌呤）、继代培养基（vw培养基辅以0.2～0.4mg/l6-苄基腺嘌呤）、离体保存培养基（vw培养基辅以2.5mg/l多效唑）、分化培养基（kc培养基辅以质量浓度10%的香蕉汁）的具体配方见表2。
表2.各种培养基的具体配方
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。