一种铜藻种质资源的离体保存方法与流程

本发明属于藻类组织培养
技术领域：
，具体涉及一种铜藻种质资源的离体保存方法。
背景技术：
：铜藻sargassumhorneri(turner)c.agardh隶属于马尾藻属(sargassum)，是近海海洋生态环境的重要组成部分，不仅可为经济鱼类提供觅食和栖息场所，还可吸附海水中的富营养化物质和重金属等，作为修复近海生态环境的工具海藻，是一类重要的经济褐藻。近年来，随着人们对其研究的逐渐深入，铜藻中富含的褐藻胶、岩藻黄素、膳食纤维、多糖等生物活性物质引起了国内外的普遍关注，被广泛应用到医药、食品、饲料和有机肥料等方面。随着铜藻资源的开发利用，加上受近岸海域开发和污染的影响，造成其资源量不断下降，因此在保护现有野生资源的同时，利用藻类组织培养方法对具有优良性状的铜藻种质资源进行离体保存对开展它的人工苗种繁育和海区增殖都有重要的意义。离体培养保存正日益成为大型经济海藻种质资源保存的常用手段，但普遍存在的问题就是继代频繁，每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。另外，铜藻藻体较大，生长速度快，在实验室不易长时间保持其藻体的正常活性，给铜藻种质资源的离体保存带来很大困难。目前，国内外对铜藻的研究主要集中在生态学、人工增养殖和繁殖生物学等方面，但有关其种质资源保存的研究还比较少。中国发明专利“一种利用低温保存铜藻受精卵的方法”(公布号为cn104145946a的)中公开了利用低温保存铜藻受精卵的方法，该方法是将受精卵于4-8℃下保存，使其在假根伸长之前完成异地跨地区运输从而进行苗种培育，而对于铜藻种质的室内离体培养保存目前尚无有效的保存方法。技术实现要素：本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种铜藻种质资源离体保存的方法，从而有效的进行铜藻种质资源的离体保存。本发明的铜藻种质资源离体保存的方法，包括如下的步骤：1)将要进行保存的铜藻种质资源进行清洗；2)将清洗好的铜藻取藻株主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用消毒海水快速冲洗3～4次，冲洗后灭菌条件下切取藻株主枝尖端作为离体保存的对象；所述的藻株主枝尖端，其长度优选为8～12cm3)将切取的藻株主枝尖端放入保存培养基中，在5～8℃、光照强度为2000～2500lx，光周期为10l:14d，充气条件下进行保存；定期更换培养基所述的述的种质保存培养液是在灭菌海水中加入0.1mol/l的nano3，0.1mol/l的nah2po4和1mg/l烯效唑；所述的培养液优选每10天更换一次；所述的光照由白色荧光灯提供；4)待保存的藻株主枝生长到长度不短于15厘米时，去掉藻株主枝的基部，将保留的藻株尖端继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。(5)所述保存后恢复生长步骤为：取出离体保存6个月的藻体，转入外尺寸为长80cm×宽45cm×高40cm的循环水箱中，培养液为正常海水。培养条件为：温度10～15℃，光照强度4000～5000lx，光周期12l:12d，充气量较大，使藻体上下翻滚，每7天换水量为总水体的50％，藻体保持旺盛生长，经过约15～20天的培养，藻体长至20厘米以上，即可用于后续育苗使用。本发明所提供的方法进行铜藻离体保存，可大大延长了铜藻藻株主枝的保存时间。经保存的材料可快速恢复生长，并能进行大量繁殖，大量繁殖所获得的种苗与未经保存过的种苗相比，其形态特征和长势无明显差异。本发明的方法可在短期内提供大量的铜藻优质种苗，有效解决了铜藻种质资源保存及规模化育苗问题，具有广泛的应用前景。附图说明图1：添加不同浓度烯效唑的培养液对叶绿素a含量的影响图；图2：添加不同浓度烯效唑的培养液对类胡萝卜素含量的影响图。具体实施方式申请人研究中发现，用灭菌海水对铜藻主枝尖端进行培养保存，30d时即出现藻体颜色明显变浅，尖端发白等表观性状，通过对其叶绿素a和类胡萝卜素含量的测定发现均明显降低。所以，本申请配制保存培养基的目的就是为了在保存过程增加藻体的干重，并保持叶绿素a和类胡萝卜素的含量。下面对本发明的方法进行详细的描述。实施例1本实施例所配制的种质保存培养液，其组分如下：加入0.1mol/lnano3，0.1mol/lnah2po4，1mg/l烯效唑的灭菌海水。上述组分及配比，既可以延缓铜藻保存时的生长速度，又不影响其保存后的恢复生长。对铜藻的保存步骤如下：(1)选择具有优良性状的铜藻种质，用毛刷和镊子清除表面的附着生物，然后用海水反复清洗去除泥沙及杂质；(2)将处理好的铜藻放在超净工作台上，取藻体主枝用体积浓度75％的酒精浸泡25～30s，然后用大量消毒海水快速冲洗3～4次，用灭菌的解剖刀切取藻体主枝尖端10厘米的片段作为离体保存的对象；(3)种质保存的条件为：在容积为1000ml的三角瓶中进行，每个三角瓶装800ml培养液，放置两株藻体，微量充气，使培养液表面有小气泡冒出；保存温度为5～8℃，光照强度为2000～2500lx，光周期为10l:14d，由白色荧光灯提供。(4)定期观察保存藻体的生长情况，与对照(正常灭菌海水中培养)相比，藻体生长缓慢，长度明显缩短，主枝明显增粗，约30天左右，藻体长度长至15厘米左右，用解剖刀剪去基部，仅保留尖端10厘米的藻体片段，再继续放入种质保存培养液中进行种质保存培养。不同培养液、温度、光照强度、充气大小对保存效果的影响如下所示，测定的生长指标包括藻体的鲜质量(freshweight,fw)、藻体长度以及表观症状等，其中鲜质量的增加量以比生长速率(relativegrowthrate,rgr)表示，计算公式如下：rgr＝[(wt/w0)1/t-1]×10式中wt为实验中期或结束时藻体鲜重(g)，w0为实验开始时藻体鲜重(g)，t为培养时间(d)。(1)培养液对铜藻离体保存的影响将试验材料放入不同浓度烯效唑的培养液中保存，每组处理三个平行，保存条件：温度10℃，光照强度2500lx，光周期12l:12d，微量充气。结果表明，铜藻在烯效唑浓度为1.0mg/l保存时间最长，为182天，具体情况见表1。表1不同培养液对铜藻种质资源保存效果(2)温度对铜藻离体保存的影响将试验材料放入本发明的保存培养基中，分别放置于温度5℃，8℃，10℃，15℃的光照培养箱保存，每组处理三个平行，其他保存条件：光照强度2500lx，光周期12l:12d，微量充气。结果表明，铜藻在温度为5℃培养箱中保存时间最长，为187天。具体情况见表2。表2不同温度对铜藻种质资源保存效果(3)光照强度对铜藻离体保存的影响将试验材料放入本发明的保存培养基中，分别放置于1000lx，1500lx，2000lx，2500lx，3000lx的光照强度下保存，每组处理三个平行，其他保存条件：温度10℃，光周期12l:12d，微量充气。结果表明，铜藻在光照强度为2000lx保存时间最长，为187天，具体见表3。表3不同光照强度对铜藻种质资源保存效果(4)充气量对铜藻离体保存的影响将试验材料分别放置于不充气，微量充气(培养液表面有小气泡冒出)，充气量大(藻体上下翻滚)下保存培养，温度10℃，光照强度2500lx，光周期12l:12d。结果表明，铜藻在充气量较小的条件下保存时间最长，为157天，具体见表4。表4充气大小对铜藻种质资源保存效果(5)培养液对铜藻主要光合色素含量的影响叶绿素a和类胡萝卜素含量的测定方法如下：取0.1g新鲜藻体研磨成匀浆状，加入8ml80％丙酮置于4℃黑暗处抽提24h。4000r/min，4℃离心10min弃沉淀，上清用80％丙酮定容至10ml。以80％丙酮作为空白对照，测定665、652、510、480nm波长处的吸光值。重复3次以上，计算平均值。叶绿素a的含量按照公式w(chl-a)＝(16.29od665－8.54od652)×v/w/1000计算，类胡萝卜素的含量按照公式w(car)＝7.6×(od480－1.49×od510)×v/w/1000，式中v为浸提丙酮的体积(ml)，w为藻体质量(g)，单位为mg/g。将试验材料放入不同浓度烯效唑的培养液中保存30d，分别测定叶绿素a和类胡萝卜素的含量，以保存材料第0天的值作为对照。结果表明，在自然灭菌海水中培养30d，叶绿素a和类胡萝卜素的含量显著下降至对照的58.43％和73.36，用添加了不同质量浓度(0.1～2.0mg/l)烯效唑的培养液培养30d后铜藻主要光合色素含量的差异见附图。由图1可见，在0.1～2.0mg/l质量浓度范围内，随烯效唑质量浓度的提高,铜藻藻体的叶绿素a含量逐渐增高。其中,0.1和0.5mg/l实验组藻体叶绿素a含量显著低于对照,较对照分别降低了29.4％和6.5％，而1.0和2.0mg/l的实验组与对照无显著差异。类胡萝卜素的含量也是0.1和0.5mg/l实验组显著低于对照；1.0mg/l实验组的类胡罗素含量最高，为0.092±0.007mg/g鲜重，略高于对照组(0.090±0.002mg/g鲜重)；2.0mg/l的实验组的类胡罗素含量为0.090±0.008，与对照无显著差异。可见,在培养液中添加适量的烯效唑能够显著提高铜藻藻体的叶绿素a和类胡罗素的含量，且以1.0mg/l质量浓度下最利于叶绿素a和类胡罗素的合成与积累。上述结果表明本发明的培养液能有效的进行铜藻离体的长期保存。(6)离体保存的铜藻生长恢复情况将具有优良性状的铜藻种质在本发明的培养液中保存182天后取出进行恢复生长，所述保存后恢复生长步骤如下：取出离体保存的藻体，转入外尺寸为长80cm×宽45cm×高40cm的循环水箱中，培养液为正常海水。培养条件为：温度10～15℃，光照强度4000～5000lx，光周期12l:12d，充气量较大，使藻体上下翻滚，每7天换水量为总水体的50％。表5离体保存后恢复的铜藻和保存前铜藻生长30d的比较材料比生长速率长度(cm)保存前2.43±0.0525.11±1.03保存后2.41±0.1624.89±1.77保存材料经培养后，生长旺盛，颜色正常，经生长指标的测定显示保存后铜藻的生长没有因长期保存而受到不良影响。经过约15～20天的培养，藻体即可长至20厘米以上，即可用于后续育苗使用。当前第1页12