一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法与流程

本发明涉及无患子繁殖领域，尤其涉及一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法。
背景技术：
：无患子(SapindusmukorossiGaertn.)为无患子科无患子属落叶乔木，广泛分布于我国淮河流域以南地区、日本及东南亚各国，是一种集洗涤、药用、绿化、水土保持及生物柴油生产等用途于一身的多功能树种。无患子的果实具有很高的经济价值和药用价值，其果皮中含有的皂苷及苷元均具有很强的非离子表面活性，是优良的天然洗涤剂；同时还具有多种生物活性，能够起到抗菌和抗肿瘤的功效。无患子的种仁含油率高达42％，是制备生物柴油的理想原料。此外，无患子树型优美，根系发达，生长迅速，对土壤要求不严，且可吸收空气中的二氧化硫及汽车尾气等有害气体，在绿化和水土保持方面亦具有十分重要的价值。近年来，随着无患子综合开发利用价值的提高，无患子需求量也在不断加大；优质丰产的果用型无患子良种选育及其配套的苗木高效快繁技术及丰产高效栽培技术已成为无患子产业发展的技术瓶颈及亟待解决的技术问题。目前，在生产上无患子的繁殖栽培主要采用传统的播种育苗方法，由于无患子种子在自然条件下病虫害严重，致使萌发率很低，且通过种子繁殖不利于无患子优良性状的保持。此外，通过利用扦插技术对无患子进行繁育的研究已有报道，但一般是以8-20cm长的无患子春季枝条作为繁殖材料，且繁殖过程繁琐，生根时间较长。播种和扦插育苗方法均受季节、地域等自然因素的影响，其操作均有严格的时空要求，很难满足规模化繁育无患子优良品种的需求。为了解决上述传统栽培方法存在的问题，国内外研究者以无患子的叶片、叶柄和茎段等材料为外植体，通过植物组织培养技术，进行了无患子离体再生研究，并成功诱导出完整的无患子再生植株。虽然组织培养的方法避免了繁殖季节和地域等自然因素的影响和限制，但植物整个离体再生过程需要严格的无菌环境，一方面操作过程复杂繁琐，生产成本较高；另一方面将组培再生的完整植株移栽至大田的过程中存在过程繁琐，费时费力且成活率较低等问题。因此，通过组织培养技术对无患子进行繁育的方法也很难满足大规模造林工程对无患子苗木数量和质量的需求。因此，针对目前无患子繁育所存在的诸多问题，急需开发一种简单、高效且成本较低的无患子快繁技术即一种快速繁殖无患子优良株系幼苗的方法。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种步骤简单、操作方便、繁殖速度快、成本较低，且不受季节和地域等自然因素限制的的快速繁育无患子优良株系幼苗的方法。本发明是通过以下技术方案实现的：一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，包括如下步骤：(1)取材6-7月份，选取田间多年生具有优良农艺性状的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成适宜长度的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由Tween和高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有吲哚乙酸和铁盐的生根促进液中进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的营养补液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为2.0-5.0cm厚的河沙，下层是3.0-5.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔1-3周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的营养补液。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中优良农艺性状指具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中适宜长度为2.0-4.0cm长度。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中消毒溶液由0.5-1.0％(v/v)Tween和0.1-0.4％(w/v)高锰酸钾混合而成。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中消毒溶液的使用方法为：将待消毒的样品置于消毒溶液中消毒5-10min。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中将消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有吲哚乙酸和铁盐的生根促进液中处理80s，其中，吲哚乙酸的浓度为1200mg/L。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中河沙为粒径为0.3-0.5mm的河沙。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)和(5)中营养补液具体为不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中温室大棚为温度25-30℃、相对湿度80-85％的温室大棚。作为本发明的优选方式之一，所述铁盐的组成配方为：74.6mg/LNa2·EDTA，55.6mg/LFeSO4·7H2O。本发明相比现有技术的优点在于：其一，本发明所用的外植体是2.0-4.0cm、携带腋芽的无患子微茎段，与传统的长8-20cm的扦插枝条相比，极大节约了种质材料，提高了繁殖效率；其二，本发明所用的外植体取材于无患子田间优良株系的当年生枝条，一方面，取材方便，材料丰富；另一方面该枝条为具有旺盛的生长状态，易生根且不易腐烂；其三，本发明采用生根促进液浸泡茎段80s，21-28d就可以获得完整的无患子再生植株，不仅比传统栽培方法获得无患子植株的速度快，而且比现有报道中有关利用组织培养技术对无患子进行快繁的速度快；其四，本发明中所涉及的无患子再生小苗为腋芽萌发所产生，能保持母本植株原有的优良性状；其五，本发明采用了将微茎段扦插于营养基质中于温室大棚内直接生根，一步成苗，一方面避免了季节、地域等自然因素的影响和限制；另一方面也避免了无患子组织培养繁育过程的繁琐及后续组培再生苗驯化移栽成活率低的缺陷；其六，本发明仅对微茎段进行简单的消毒处理，相比组织培养繁殖方法，无需严格的无菌操作环境，在室外即可进行，不仅生产再生小苗成本低，而且操作方法简单，易于掌握，可使植株数量在较短时期内实现几何级倍增，适于无患子的工厂化育苗；其七，本发明严格优化并控制生根促进液的种类和浓度，使其成为无患子不定根诱导的最佳浓度；严格优化取材时间，使植株生长状态最佳；其八，本发明的消毒剂、营养补液以及营养基质等的种类和浓度选择也严格与无患子生长过程中所需的必要元素相配合，同时避免有害元素的引入。附图说明图1是实施例3中的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法的无患子微茎段幼苗再生图；图2是实施例3中的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法的无患子微茎段幼苗所对应的不定根形成图。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1本实施例的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，包括如下步骤：(1)取材7月份，选取田间多年生具有优良农艺性状(具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状)的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成4.0cm长的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由1.0％(v/v)Tween和0.4％(w/v)高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒10min，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有1200mg/L吲哚乙酸和铁盐(74.6mg/LNa2·EDTA，55.6mg/LFeSO4·7H2O)的生根促进液中80s，进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为5.0cm厚的粒径为0.5mm的河沙，下层是5.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温度30℃、相对湿度85％的温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔3周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液。实施例2本实施例的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，包括如下步骤：(1)取材6月份，选取田间多年生具有优良农艺性状(具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状)的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成2.0cm长的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由0.5％(v/v)Tween和0.1％(w/v)高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒5min，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有1200mg/L吲哚乙酸和铁盐(74.6mg/LNa2·EDTA，55.6mg/LFeSO4·7H2O)的生根促进液中80s，进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为2.0cm厚的粒径为0.3mm的河沙，下层是3.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温度25℃、相对湿度80％的温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔1周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液。实施例3本实施例的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，包括如下步骤：(1)取材6月份，选取田间多年生具有优良农艺性状(具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状)的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成3.0cm长的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由0.8％(v/v)Tween和0.3％(w/v)高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒8min，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有1200mg/L吲哚乙酸和铁盐(74.6mg/LNa2·EDTA，55.6mg/LFeSO4·7H2O)的生根促进液中80s，进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为3.0cm厚的粒径为0.4mm的河沙，下层是4.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温度28℃、相对湿度83％的温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔2周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液。实施例4本实施例的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，测试了不同取材时期对无患子微茎段离体快繁的影响，包括如下步骤：(1)取材分别于4、5、6、7、8、9和10月份，选取田间多年生具有优良农艺性状(具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状)的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成3.0cm长的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由0.8％(v/v)Tween和0.3％(w/v)高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒8min，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端置于含有1200mg/L吲哚乙酸和铁盐(74.6mg/LNa2·EDTA，55.6mg/LFeSO4·7H2O)的生根促进液中80s，进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为3.0cm厚的粒径为0.4mm的河沙，下层是4.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温度28℃、相对湿度83％的温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔2周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；42d后统计微茎段的生根情况和成苗情况。研究结果表明(表1)不同取材时期对无患子一年生微茎段离体快繁具有重要影响。4月份，由于无患子枝条刚萌发尚未木质化，微茎段处理后基部易出现坏死现象，生根率和成苗率较低；6-7月份，的微茎段离体再生效果最佳，生根率和成苗率最高均达到100％；随着月份的增加，枝条的木质化程度越来越严重，微茎段的生根率和成苗率出现下降的趋势；其中8-9月份微茎段的离体快繁效率均在80％以上，10月份的微茎段离体再生率出现显著下降，推测原因为木质化程度越来越高，微茎段的再生能力下降等原因，影响了微茎段的再生效率。表1取材时间对无患子微茎段离体快繁的影响取材时间(月份)生根率(％)成苗率(％)411.410.5573.772.96100100798.698.6887.287.2983.183.11041.341.3注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。实施例5本实施例的一种快速繁育无患子优良株系幼苗的方法，测试了不同浓度生根处理液和处理时间对无患子微茎段离体再生的影响，包括如下步骤：(1)取材6月份，选取田间多年生具有优良农艺性状(具有高产、优质、抗逆性强中一种或几种的性状)的无患子当年生健壮枝条作为外植体来源；(2)外植体的预处理将步骤(1)中的无患子枝条剪切成3.0cm长的带有1个腋芽和1-2片叶子的微茎段，流水冲洗后，通过由0.8％(v/v)Tween和0.3％(w/v)高锰酸钾混合而成的消毒溶液进行表面消毒8min，捞出后阴干、备用；(3)外植体不定根的诱导处理将步骤(2)中经过消毒处理后的微茎段的形态学下端分别置于含有不同浓度的吲哚乙酸(800、1200、1600、2000mg/L)和铁盐(0.0、37.3、55.9、74.6mg/LNa2·EDTA+0.0、27.8、41.7、55.6mg/LFeSO4·7H2O)的生根促进液中处理20、40、80、120s，进行不定根的诱导处理；(4)外植体的定植将步骤(3)中经过生根促进液处理后的无患子微茎段的形态学下端切口插入营养基质盘中，以互不重叠为准，并喷施不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液；其中，营养基质盘由上下两层构成，上层为3.0cm厚的粒径为0.4mm的河沙，下层是4.0cm厚的营养土；(5)外植体的成苗管理将步骤(4)中定植后的无患子微茎段盖上塑料膜，于温度28℃、相对湿度83％的温室大棚中进行不定根的诱导和成苗培养；培养期间，每隔2周喷施一次不含有机元素、含有2倍铁盐的1/4MS基本培养液。研究结果表明(表2)不同浓度生根处理液及处理时间对无患子微茎段的离体再生具有重要的影响；其中铁盐浓度与吲哚乙酸存在协同效应,铁盐的存在能够大大提升吲哚乙酸的生根效果；研究结果表明微茎段的形态学下端浸入含有1200mg/L吲哚乙酸和74.6mg/LNa2·EDTA、55.6mg/LFeSO4·7H2O的混合溶液中处理80s,微茎段的离体再生率最高，高达100％。表2生根处理液浓度和处理时间对无患子微茎段离体再生的影响注：数据为平均值，每个处理包含120个外植体，每个处理重复三次。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3