一种甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法与流程

本发明涉及一种昆虫饲养繁殖方法，具体涉及一种甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法，属昆虫饲养繁殖技术领域。

背景技术：

甘蔗蚜虫（melanaphissacchari）有甘蔗黄蚜longiunguissaccharizehntner（又称高粱蚜）、甘蔗绵蚜ceratovacunalanigerazehntner（又名粉蚜）和刺根蚜tetrancurabirsutabaker三种，为同翅目，蚜虫科。其中甘蔗黄蚜以成虫或若虫群集甘蔗叶片叶背吸食汁液，使蔗叶枯黄甚至凋萎，分泌出的大量蜜露可引起煤烟病，影响光合作用，造成产量减产、糖分下降。甘蔗黄蚜也是传播甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒和甘蔗黄叶病毒等多种植物病毒的传播媒介昆虫，以非持久性方式传播。

目前，甘蔗黄蚜作为病毒传播途径和抗药性试验等实验材料，所用虫源一般直接采自田间寄主植株，需要花费大量人力物力，并且在自然环境下，甘蔗黄蚜的生长繁殖受季节和环境条件影响，不能保证有足够的实验材料，且均一性较差。因此，急需解决甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖技术问题，建立简单易行、快速大量繁殖技术体系，为甘蔗抗病虫育种及防治甘蔗黄蚜的新型农药的研发提供可靠的、均一性好、不受季节限制的虫源实验材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种室内人工大量繁殖甘蔗黄蚜的方法，可以方便快捷周年持续提供足够数量的无病毒、无菌、均一性好的甘蔗黄蚜。

本发明的一种甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法，其特征在于室内人工饲养繁殖的步骤如下：

（1）无菌无毒甘蔗组培瓶苗的培养：培养、扩繁经检测不携带病毒的无菌无毒甘蔗组培瓶苗，并以无菌无毒甘蔗组培瓶苗，作为甘蔗黄蚜的饲养介质；

（2）甘蔗黄蚜的消毒：从田间采集带有甘蔗黄蚜的甘蔗叶片，在群集一起的甘蔗黄蚜群体中抽取出若干个体，采用分子生物学rt-pcr检测方法确定没有携带病毒后，先用无菌水冲洗，无菌滤纸吸干水分，然后在超净工作台上用消毒剂消毒3~5min，再用无菌水冲洗3~5次，用无菌滤纸吸干水分，获得无菌无毒甘蔗黄蚜；

（3）甘蔗黄蚜无病毒、无菌化、均一化培养：在步骤（2）的无菌无毒甘蔗黄蚜中，选取大小一致的若干个体，接种于若干无菌无毒甘蔗组培瓶苗中，旋紧含透气膜的瓶盖，置于18~30℃、光照8~16h·d^-1、光强2000~10000lx条件下培养；以无菌无毒甘蔗组培瓶苗作为甘蔗黄蚜的饲养介质，在人工饲养繁殖过程中，每间隔一段时间更换新的无菌无毒甘蔗组培瓶苗，即可不间断获得无病毒、无菌、均一的甘蔗黄蚜种群；

（4）甘蔗黄蚜无病毒无菌化传代培养：取步骤（2）或（3）获得的甘蔗黄蚜作为虫源，按步骤（3）的饲养方法，传代繁殖，从而保持无毒无菌甘蔗黄蚜的持续传代繁殖。

其中，步骤（2）所述的消毒剂是重量百分浓度为0.1%的hgcl2。

步骤（3）所述接种，指每瓶接入一只无菌无毒的甘蔗黄蚜。

步骤（3）所述的每间隔一段时间，是每间隔10~12d。

本发明的优点及有益之处：

1、本发明的甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法，在室内利用无菌无毒甘蔗组培瓶苗人工饲养繁殖无菌无毒甘蔗黄蚜，不受自然条件的影响，可以周年提供足够数量的无毒、均一虫源。

2、无菌无毒甘蔗黄蚜在密闭的培养容器内生长繁殖，不会迁移至外界环境中，避免了对周边作物病原的传播和相应病害的流行。

3、无菌无毒甘蔗黄蚜在密闭的培养容器内生长繁殖，常年保持无菌状态，不受环境微生物和天敌影响。

4、用无菌无毒甘蔗组培瓶苗作为饲养介质，成本低、易操作。

附图说明

图1：甘蔗黄蚜接种2天后的无菌无毒甘蔗组培瓶苗。

图2：甘蔗黄蚜在无菌无毒甘蔗组培瓶苗中的繁殖后代。

图3：甘蔗黄蚜在无菌无毒甘蔗组培瓶苗中生长繁殖曲线。图中，横坐标表示接种后的天数，纵坐标表示繁殖倍数。

具体实施方式

为了充分公开本发明的甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1、一种甘蔗黄蚜室内人工饲养繁殖方法，包括以下步骤：

从田间取生长健壮、无病虫害的福农41甘蔗植株，砍成单芽茎段，选择生长饱满的芽，于52℃恒温循环热水浴处理30min，置37℃催芽，芽高不低于5cm时，取叶片，参考发表在《annalsofappliedbiology》（luoetal.,2016）和《virusgenes》（gaoetal.,2012）文献所描述的甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的rt-pcr检测方法，确定没有携带病毒后，取芽，芽用75%乙醇消毒0~30s，用0.1%hgcl2消毒15min，剥去3~5片叶鞘，切下长约1cm带生长点的茎尖接种于培养基a（ms+6-ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+活性炭0.5g/l+糖20g/l）中，于25±2℃、光照10~12h·d^-1、光强2000~3000lx条件下的人工气候箱里培养，每20d转接到相同成分的新鲜培养基中，长出丛芽后转入培养基b（ms+6-ba1.0mg/l+kt0.5mg/l+糖20g/l+琼脂5~7g/l）中，每20d转接到相同成分新鲜培养基中，生长至3~5cm高度的无菌无毒甘蔗组培瓶苗作为甘蔗黄蚜的饲养介质。

田间取带有甘蔗黄蚜的甘蔗叶片，从群集一起的甘蔗黄蚜群体中随机抽取出12头个体，参考发表在《annalsofappliedbiology》（luoetal.,2016）和《virusgenes》（gaoetal.,2012）文献所描述的甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的rt-pcr检测方法，确定没有携带病毒后，将带有其余甘蔗黄蚜的甘蔗叶片先用无菌水冲洗，随后用无菌滤纸吸干水分，在超净工作台上按无菌操作方式进行消毒、接种。然后用重量百分浓度为0.1%的hgcl2消毒4min，再用无菌水冲洗3次后，将其置于无菌滤纸上，把带甘蔗黄蚜的叶片分割成仅携带1只甘蔗黄蚜的小块叶片，接入无菌无毒甘蔗组培瓶苗中，如图1所示，每瓶接种一块叶片，即每瓶接入一只无菌无毒的甘蔗黄蚜。。

将接种过的无菌甘蔗组培瓶苗置于22±1℃、光照12h·d^-1、光强6000lx条件下培养，48h内可观察到甘蔗黄蚜迁移到无菌植株上。甘蔗黄蚜在无菌无毒甘蔗植株上生长繁殖，3~5d一代，世代重叠。如图2所示，无菌无毒甘蔗黄蚜在室内人工饲养繁殖的过程中，随着人工饲养繁殖的时间延长，甘蔗黄蚜种群数量也逐渐增加；如图3所示，当人工饲养繁殖8d之后，甘蔗黄蚜种群数量急剧扩增；人工饲养繁殖10d时，平均繁殖倍数为29.8倍；人工饲养繁殖12d时，平均繁殖倍数为58.5倍。这时由于甘蔗黄蚜群体数量过大，一些甘蔗黄蚜个体出现死亡现象。因此，人工饲养繁殖10~12d时剪取带有甘蔗黄蚜的无菌植株叶片转接到新鲜无菌组培瓶苗中继续传代繁殖；或者选取均一性好的甘蔗黄蚜作为传毒实验或抗药性等实验的虫源。以上甘蔗黄蚜经过分子生物学rt-pcr检测，没有检测到甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒和甘蔗黄叶病毒。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。