本发明涉及中医药防治疾病效果评价领域，具体涉及一种体内缺氧型糖尿病前期动物模型的构建方法。
背景技术：
随着生活方式和饮食结构的改变，我国ii型糖尿病发病率日趋高发，糖尿病及其后续并发症极大的威胁着人类生命及生活质量，给患者及家庭带来沉重的经济负担。ii型糖尿病的发生一般经历“正常糖耐量→糖尿病前期(糖调节受损)→t2dm”渐进的过程。糖尿病前期具有可逆性，是早期干预的重要阶段，但临床上暂时没有针对糖尿病前期的安全、有效的药物。
人类疾病的动物模型是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。糖尿病发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动糖尿病的防治来之缓慢，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。因此，建立一种符合人类ⅱ型糖尿病发病特点的动物模型，借助于动物模型的间接研究，观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，对于研究ⅱ型糖尿病发病机制及研发预防ⅱ型糖尿病药物及治疗方法意义重大。目前，糖尿病动物模型的研究比较多关注于ii型糖尿病和糖尿病并发症领域，已有较多类型、较为成熟的ii型糖尿病模式动物，而对于“糖尿病前期”动物模型的研究较少。简单按照饮食加化学药物诱导的制作方式虽然周期较短，但药物剂量不易控制，容易直接造成ii型糖尿病。
目前糖尿病及糖尿病前期动物模型造模成功的评价指标多关注于血糖异常单一指标。在专利申请cn106212858a中，公开了一种高脂饲料配方，通过饲喂该配方饲料10周，可将猴子制备成ii型糖尿病，检测指标是血糖值及血脂。在专利申请cn102771673a中，也公开了一种纯化高脂饲料配方，通过喂养该配方饲料3个月，可制备的代谢综合征动物模型，模型成功的检测指标是血糖值异常及胰岛素水平异常。在专利申请cn102812921a中，公开了一种高糖高脂饲料加上一定浓度的酒精喂养4-20周可制备ii型糖尿病的模型制作方法，模型制作成功的标志也是高血糖、高血脂。而随着研究的深入，目前临床学者们认为像糖尿病这类慢性病的预防和治疗更应该关注于临床替代终点，而不仅仅关注于单一指标的降低。因此，以单一指标来评价动物模型及评价预防治疗药物的疗效，并不合适。
技术实现要素：
本发明目的在于克服现有技术的不足，建立一种体内缺氧型的糖尿病前期动物模型，通过高脂高糖长程喂养模拟主流的饮食结构改变因素，以体内缺氧模拟气虚，气血不足，并采用多种相关指标进行评价造模效果，为评价防治糖尿病前期药物的疗效提供一种稳定可靠的动物模型。
为此，本发明采用了以下技术方案：
一种体内缺氧型糖尿病前期动物模型的构建方法，其包括：用高脂高糖饲料长程喂养大鼠24-30周，当大鼠出现下列症状时，缺氧型糖尿病前期动物模型构建成功：组织血氧浓度降低；血流变学指标变差；缺氧诱导因子表达增加。
在本发明优选的一个方面，所述缺氧型糖尿病前期动物模型构建成功时，大鼠还出现下列症状中的至少一种：血沉指数异常；血糖指数异常；血脂异常。
在本发明优选的一个方面，所述高糖高脂饲料配方以重量计包括猪油18％、蔗糖15％、蛋黄粉12％、酪蛋白5％、胆固醇1.2％、胆酸钠0.2％和大鼠维持饲料48.6％。
在本发明优选的一个方面，所述大鼠为spf级成年wistar雄性大鼠。
在本发明优选的一个方面，所述组织血氧浓度降低为采用血氧测定仪测得氧饱和度小于90％。
在本发明优选的一个方面，所述血流变学指标变差为采用血流变分析仪测得全血黏度、血浆黏度和红细胞压积显著高于正常值。
在本发明优选的一个方面，所述缺氧诱导因子表达增加为采用酶联免疫吸附法测定血浆中的缺氧诱导因子表达从0到数量级大于102以上。
本发明的有益效果主要体现在：现有药物造模法虽然周期短，但与糖尿病前期的症状不太符合，而高脂高糖饲料喂养造模的大部分目标是血脂异常动物模型，用于降血脂药物的评价。
对于“糖尿病前期”目前没有较为明确的定义，在中国ii型糖尿病防治指南(2013年版)中，糖尿病前期仍然采用who1999年分类标准：以单一的血糖值为指标判断，以空腹血糖6.1-7.0mmol/l为空腹血糖受损(ifg)或餐后2小时血糖7.8-11.1mmol/l为糖耐量受损(igt)。
传统中医认为，糖尿病及糖尿病前期的病因在于“脾气虚”。中国的发病率在上升，公认原因在于中国人的饮食结构在改变，高蛋白高营养成分食物的比例在增加，与西方人的食物成分结构的距离在接近，肉类食物的增加，纤维类食物减少，肠蠕动减慢，食物在肠胃中停留时间延长，致使脾胃负担过重。脾胃长期超负荷工作,造成脾气的耗损，导致脾虚。脾虚使运化失常，气血不足，脏腑功能失调，阴阳失衡，血糖升高，这是糖尿病发病的原因。而发明人发现，糖尿病前期除了血糖值异常之外，更多的会出现“气虚”、“血淤”等症状，用现代医学的指标反映出来就是体内出现缺氧症状，解决了体内缺氧症状，改善体内能量代谢环境，可以改善糖尿病前期症状。
因此，本发明采用多指标的评价及饮食长期喂养的造模方法将更符合实际发病机制，本发明提供了一种稳定性高、重复性好、方法可控、评价指标符合临床实际的体内缺氧性糖尿病前期大鼠动物模型，为中医药及天然药物防治糖尿病前期的临床前期研究提供实验基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
不同饲料配方对糖尿病前期动物模型造模的影响
1.饲料配方和造模方法模拟糖尿病发病进程和机制，参考现有ii型糖尿病动物模型制备方法，以高糖高脂饲料长程喂养大鼠，以出现空腹血糖值为6.1～7.0mmol/l或糖负荷后血糖为7.8～11.1mmol/l为终点，判断造模成功。将105只spf级成年wistar雄性大鼠随机分为4组，1组15只作为空白对照组，喂以普通大鼠维持饲料；另外3组每组30只，分别喂以不同配方高糖高脂饲料。依据动物每只每天食用量约为100g/kg.bw每日相同时间投食、给水，次日回收饲料，称重，计算食量。持续喂养32周。在0周、4、8、12、16、20、24、28、32周尾部取血用血糖仪测定血糖，其中空腹血糖为禁食不禁水12小时取血，糖负荷血糖为ogtt后2小时取血。检测糖调节受损模型是否建立，观察成模周期及造模成功率，以筛选饮食配方。
表1：动物高糖高脂饲料配方g/100g
2.结果
表2：不同饲料配方喂养大鼠不同时期的空腹血糖和糖负荷后血糖值
从实验结果分析，猪油含量太低，将大大延长成模时间，而含量过高，将造成大鼠过度肥胖，造成大鼠死亡率过高而影响造模成功率，而且脂肪含量过高，饲料颗粒不容易成型，使用不便，猪油含量太低，将大大延长成模时间，而含量过高，将造成大鼠过度肥胖，造成大鼠死亡率过高而影响造模成功率，而且脂肪含量过高，饲料颗粒不容易成型，使用不便，在实验后期已出现糖尿病前期向ii型糖尿病转变的指标，因此，采用配方2：猪油18％、蔗糖15％、蛋黄粉12％、酪蛋白5％、胆固醇1.2％、胆酸钠0.2％、大鼠维持饲料48.6％(均以重量计)为优选的造模配方。
实施例2
1模型制备所需材料
1.1动物：spf级成年wistar雄性大鼠45只。按标准环境饲养，适应5天后，进行试验。
1.2饲料：普通饲料喂标准大鼠维持饲料；高脂高糖饲料为自制饲料(见实施例1)，配方为猪油18％、蔗糖15％、蛋黄粉12％、酪蛋白5％、胆固醇1.2％、胆酸钠0.2％、大鼠维持饲料48.6％(均以重量计)，将上述成分混匀，压制成粒状，紫外线灭菌消毒后备用。
1.3药物：荔枝核水提物，将中药原料荔枝核采用传统水煎提取3次，每次1小时，过滤，合并提取液后水浴浓缩至8g药材量/ml。
1.4仪器：缺氧诱导因子检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，血脂检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，近红外组织血氧参数无损监测仪(tsah-100型(清华大学生物医学工程研究所)，全自动生化分析仪(olympusau-400)，血流变分析仪(众驰伟业，zl6000i)，酶标仪(tecaninfinitem200)。
2.方法
2.1动物分组和给药：spf级成年wistar雄性大鼠45只。随机分为空白对照组、模型组、荔枝核治疗组，每组15只。空白对照组大鼠，喂以普通饲料。其余大鼠喂以高脂高糖饲料(饲料配方为：猪油18％，蔗糖15％，蛋黄粉12％，酪蛋白5％，胆固醇1.2％，胆酸钠0.2％，普通维持饲料48.6％)，依据动物每只每天食用量约为100g/kg.bw每日相同时间投食、给水，次日回收饲料，称重，计算食量。对照组、模型组大鼠饲养28周，检测指标。荔枝核组大鼠换回普通饲料喂养，同时，每天分别灌胃给药荔枝核水提物8g/kg.bw，连续4周，再检测各指标。
2.2指标检测：采用近红外组织血氧参数无损监测仪将两探头相对置于大鼠头部两侧，监测脑部局部组织氧饱和度的绝对量。
大鼠禁食12h，水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，取全血做血气分析；离心(3000r/min,10min)，取血清，加入相应试剂盒中，全自动生化检测仪测定甘油三酯、总胆固醇。取离心血清，严格按照试剂盒说明书进行，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定缺氧诱导因子-1α表达水平。
大鼠禁食12h，水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，肝素抗凝，分别取抗凝血1ml和抗凝血离心(3000r/min,10min)后的血浆用血液粘度仪测定全血粘度、红细胞压积和血浆粘度，采用全自动血沉分析仪检测血沉指数。空腹血标本采用己糖激酶法测定血糖值。
2.3统计处理：所得数据统一采用spss10.0软件分析，定量资料t检验，显著性水准＝0.05.
3结果(见以下表3和表4)
表3：体内缺氧型糖尿病前期大鼠血生化指标
从表3各指标分析，模型组与对照组均存在显著差异，但经荔枝核水提物治疗后，血糖值和甘油三酯值与模型组相比，差异并不显著，这可能与给药时间不够相关，仍需继续给药观察。
表4：体内缺氧型糖尿病前期大鼠缺氧指标
从表4各指标分析，模型组与对照组均存在显著差异，经荔枝核水提物治疗后，各指标均能好转，证明造模成功。