一种确定双壳贝类积温促熟温度的方法与流程

本发明属于海洋贝类养殖评价
技术领域：
，具体涉及一种基于心电参数确定双壳贝类积温促熟最佳温度的方法。
背景技术：
：贝类产业是我国海水养殖产业的重要组成部分,养殖产量超过海水养殖总产量的72％(中国渔业统计年鉴,2016)。以扇贝为代表的贝类养殖曾引领我国海水养殖的第三次浪潮，推动了养殖产业的快速发展。标准化的人工育苗是双壳贝类大规模商业化养殖的前提条件，而亲贝培育又是人工育苗的重要技术环节，直接影响着配子的质量、卵子的受精率、受精卵的孵化率以及幼虫的变态率等。因此，经济贝类培育过程中性腺发育的好坏,直接影响着苗种生产、生长与养殖。影响贝类性腺发育的因素除了自身以外,还包括温度、盐度、饵料供应、种贝密度以及水环境等多种综合因素。许多学者都认为,影响海洋无脊椎动物生殖和发育的最重要因子是温度。双壳贝类栖息环境的水温波动与其性腺发育有密切关系，如水温对其呼吸、摄食、消化、排泄、运动、生长、性腺发育与繁殖均产生重要作用。目前，人工控温条件下的性腺发育和繁殖规律已经在栉孔扇贝(chlamysfarreri)、虾夷扇贝(patinopectenyessoensis)、海湾扇贝(argopectenirradias)、华贵栉孔扇贝(chlamysnobilis)、太平洋牡蛎(crassostreagigas)、菲律宾蛤仔(ruditapesphilippinarum)、紫贻贝(mytilusedulis)等双壳贝类物种中得到开展。现阶段，双壳贝类性腺发育的研究主要通过肉眼解剖观察,石蜡切片光镜观察等方法。上述方法虽然能够从个体、组织和细胞水平等不同角度在不同程度上指示双壳贝类的选种指标，但是实验通量低、周期长，较难实现实时实地快速检测。而且，个体、组织和细胞水平的检测往往需要活体采样，某种程度上会导致育种候选个体/群体损伤甚至死亡，无法很好的保证其活性作为后续育种和传代的亲本，尤其是对于亲贝数量较少的种群或者濒危双壳贝类。因此，提供一种具有操作简便、测定迅速、活体无损伤检测、实时实地监测双壳贝类积温促熟最佳温度的方法就成为双壳贝类育种的研究热点之一。技术实现要素：本发明的目的是建立一种基于心电参数确定双壳贝类积温促熟最佳温度的方法，利用双壳贝类心电波幅作为指标对其进行快速准确的积温促熟最佳温度的确定。本发明在不伤害育种参考个体/群体生物活性的基础上，实现心电参数指标的快速无损伤检测，解决现阶段海产经济双壳贝类人工育苗生产过程中缺少快速、准确、高效、活体测定性腺积温促熟最佳温度的问题。本发明首先提供双壳贝类心电波幅强度heartamplitude(ha)作为检测双壳贝类积温促熟最佳温度的指标的应用；本发明再一个方面提供一种确定双壳贝类积温促熟最佳温度的方法，是通过心电波幅强度来确定的；所述的方法，包括如下的步骤：1)将infraredsensors(cny-70)的红外感端粘到待检测的双壳贝类实验个体的壳外靠近心脏的位置；所述的双壳贝类壳外靠近心脏的位置，为双壳贝类壳外背部围心腔；作为优选，所述的双壳贝类实验个体的数目不少于20个；2)将待测双壳贝类个体放到水体中，待外套膜触须伸展之后，仪器连通进行检测；选择实验双壳贝类的适温范围，从低温到高温逐渐升温，进行不同温度下的心电参数的测定；作为优选，升温速度设定为0.2℃/min，每个整数温度点稳定维持10分钟；3)计算每个实验个体整数温度下的心电波幅强度，运用回归分析待测个体在适温范围温度变化过程中的最大心电波幅强度(maximumheartamplitude-mha)及其对应的温度(tmha)；对测定的实验个体的tmha进行统计，tmha平均值(m)±标准误(sem)即为该双壳贝类物种的积温促熟最佳温度。所述的双壳贝类，包含但不限于虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝；本发明还提供一种基于扇贝心跳指标的快速选种的标准，所述的标准如下：虾夷扇贝(patinopectenyessoensis)积温促熟最佳温度为8.55±0.14℃；栉孔扇贝(chlamysfarreri)积温促熟最佳温度为15.08±0.02℃；海湾扇贝(argopectenirradians)积温促熟最佳温度为18.78±0.12℃。本发明对双壳贝类进行体外非侵入性无损伤的心电参数检测，将获得的心电波幅强度作为确定其积温促熟最佳温度的依据。本发明方法结合了红外感应技术、滤波技术、波形放大技术，能够快速灵敏地检测双壳贝类的心电波形。与传统方法相比，本方法具有非侵入性、无损伤性、可长期跟踪等特点，首次将tmha作为双壳贝类积温促熟最佳温度的指标。采用本种方法能够究为双壳贝类人工育苗工作中的亲贝积温促熟及濒危双壳贝类的人工繁育提供研究基础。附图说明图1、虾夷扇贝心电波幅强度随温度变化曲线图；图2、栉孔扇贝心电波幅强度随温度变化曲线图；图3、海湾扇贝心电波幅强度随温度变化曲线图。具体实施方式本发明将心电波幅指标作为一个新兴数量指标，应用于双壳贝类的苗种生产中，为亲贝数量较少的种群或者濒危双壳贝类的无损伤繁育提供理论参考和方法指导。本发明通过对温度胁迫条件下双壳贝类的心电参数进行检测，同时分析心电波幅随温度的变化趋势，采用回归分析确定相应个体/群体的最大心电波幅及其对应的温度，建立一种基于心电参数确定双壳贝类积温促熟最佳温度的方法，为养殖双壳贝类积温促熟温度的确定提供可靠的技术手段。本发明方法的总体步骤如下：1、双壳贝类心电波形检测仪器的连接(1)infraredsensors(cny-70)的接口端以rj11连接方式接入heartbeatmonitoramplifier(amp-03)；(2)heartbeatmonitoramplifier(amp-03)和powerlab8/35八通道研究型高速记录主机(含labchartpro专业版)两端均以bnc连接方式相互连接；(3)powerlab8/35八通道研究型高速记录主机(含labchartpro专业版)以usb连接方式接入电脑(安装labcharbv7forwindows)。2、双壳贝类心电波形检测方法的标准化(1)将实验双壳贝类外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下5-7天使其适应实验环境；(2)将infraredsensors(cny-70)的红外感端用blu-tag型胶(蓝丁胶)粘到实验双壳贝类壳外靠近心脏的位置(背部围心腔中)；(3)根据实验条件，检测之前10分钟，将待测双壳贝类个体放到充气的5l的实验水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后，仪器连通进行检测。选择实验双壳贝类适温范围，从低温到高温逐渐升温，升温速度设定为0.2℃/min，每个整数温度点稳定维持10分钟进行该温度下心电参数的测定。在实验结束后，实验个体仍然放回实验前的水体环境中。3、数据分析(1)计算每只实验个体每个整数温度下的心电波幅强度-ha，运用回归分析待测个体在室温范围温度变化过程中的最大心电波幅强度mha及其对应的温度tmha；将每个个体按上述步骤重复三次或以上，作为此条件下该个体的积温促熟最佳温度tmsii；(2)对测定物种n个个体的tmha进行统计，tmha平均值(m)±标准误(sem)即为该双壳贝类物种的积温促熟最佳温度。下面以心电波幅强度为指标评价，对适温范围内的虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝进行积温促熟最佳温度确定的方法为例详细叙述本发明的方法。实施例11、扇贝心电波形检测仪器的连接：(1)infraredsensors(cny-70)的接口端以rj11连接方式接入heartbeatmonitoramplifer(amp-03)；(2)heartbeatmonitoramplifer(amp-03)和powerlab8/35八通道研究型高速记录主机(含labchartpro专业版)两端均以bnc接口相互连接；(3)powerlab8/35八通道研究型高速记录主机(含labchartpro专业版)以以usb连接方式接入电脑(安装labcharbv7forwindows)。2、扇贝心电波形检测方法的标准化：(1)将实验扇贝外壳的附着生物清除干净，放在实验条件下暂养5-7天，使其适应实验环境；(2)将infraredsensors(cny-70)的红外感端用blu-tag型胶(蓝丁胶)粘到扇贝壳外靠近心脏的位置(背部围心腔中)；(3)根据实验条件，检测之前10分钟，将待测双壳贝类个体放到充气的5l的实验水体环境中，待外套膜触须充分伸展之后，仪器连通进行检测。选择所选实验双壳贝类适温范围(虾夷扇贝1-31℃；栉孔扇贝1-37℃；海湾扇贝10-37℃)，从低温到高温逐渐升温，升温速度设定为0.2℃/min，整数温度点稳定维持10分钟进行该温度下的心电参数的测定，实验扇贝保证不少于6个个体的重复样。在实验结束后，实验个体仍然放回实验前的水体环境中。3、数据分析(1)计算每个实验扇贝个体整数温度下的心电波幅强度-ha，运用回归分析待测个体在室温范围温度变化过程中的最大心电波形强度mha及其对应的温度tmha；将每个个体按上述步骤重复三次或以上，作为此条件下此个体的积温促熟最佳温度tmhai；(2)对测定物种n个个体的tmha进行统计，tmha平均值(m)±标准误(sem)即为该双壳贝类物种的积温促熟最佳温度。虾夷扇贝为冷水贝，1-31℃温度变化过程中，其mha为1.654±0.027v，对应的温度tmha-虾夷为8.55±0.14℃(图1)；栉孔扇贝为温水贝，1-37℃温度变化过程中，其mha为1.903±0.014v，对应的温度tmha-栉孔为15.08±0.02℃(图2)；海湾扇贝为温水贝，10-37℃温度变化过程中，其mha为1.622±0.026v，对应的温度tmha-海湾为18.78±0.12℃(图3)；不同生活习性的三种扇贝的tmha-虾夷<tmha-栉孔<tmha-海湾，而且与对应物种实际生产过程中经验值较为吻合，验证了tmha作为指示双壳贝类物种的积温促熟最佳温度的准确性(表1)。表1依据心电波幅测定不同扇贝物种的积温促熟最佳温度tmsi和实际生产过程中经验值t(表1)扇贝物种tmsit虾夷扇贝8.55±0.14℃8-9℃栉孔扇贝15.08±0.02℃15-16℃海湾扇贝18.78±0.12℃18-20℃应用本发明方法，选取二龄虾夷扇贝个体(n＝180，取自大连市长海县獐子岛海区)、二龄栉孔扇贝个体(n＝180，取自青岛市崂山区沙子口海区)和一龄虾夷海湾个体(n＝180，取自青岛市黄岛开发区胶南海区)随机分为两组(n＝90)，每组分为三个平行样(n＝30)。分别按照本发明测定的tmha温度(实验组)和经验值(对照组)的温度进行亲贝的积温促熟。实验过程中除了水温差异外，其他积温促熟条件(饵料、换水、充气等)保持一致。做好标记后车间暂养，跟踪统计性腺指数、产卵量、受精率、孵化率和变态率(表2)，验证本发明方法在育种工作中的应用。结果显示，每种扇贝实验组和对照组各45个个体，实验组(tmha)的性腺指数和产卵量均显著高于对照组(经验值)(one-wayanova，p<0.05)；受精率和孵化率，实验组(tmha)的略微高于对照组(经验值)，但无显著性差异(one-wayanova，p>0.05)；育苗过程中最重要指标之一的变态率，实验组(tmha)极显著高于对照组(经验值)(one-wayanova，p<0.01)。通过整个苗期生产的对比，实验组(tsim)的虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝的苗种数量的增产率对照组(经验值)分别提高48.97％，45.03％和61.51％。结果表明本发明的检测标准可以有效的确定扇贝积温促熟最佳温度，从而为扇贝的人工育苗和科研提供翔实和有效的实验方法，为我国双壳贝类的高质健康养殖提供技术支撑。当前第1页12