一种高成活率的棉花试管苗移栽方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高成活率的棉花试管苗移栽方法。

背景技术：

棉花幼胚培养，组织培养技术与转基因技术是棉花育种改良的重要手段，但通过组织培养与转基因育种获得的棉花试管苗移栽成活困难，一直是限制棉花组培育种与转基因育种技术发展的一个重要技术瓶颈。棉花属于阔叶植物，蒸腾量大，试管苗移栽很容易萎蔫死亡。

目前对于棉花试管苗移栽的研究主要从控制植株蒸发与增加植株对水分的吸收两方面进行。

国内有报道采用叶面涂抹抗蒸腾剂，根部加入促生根剂来解决组培苗移栽成活困难的问题。之后国内外许多研究者陆续报道采用嫁接技术将组织培养再生植株嫁接到棉花砧木上。涂抹抗蒸腾剂与促生根的方法需要20天激素水培促生根，并在移栽后对植株涂抹抗蒸腾剂，该方法虽然获得较高移栽成活率，但其未对移栽环境进行严格控制，存在操作繁琐，移栽成活与缓苗时间受环境影响较大的问题。

申请号为200510012491.2的国家发明专利《棉花试管苗直接移栽的基质及方法》，其主要解决问题的思路仍是从促进植株根系吸收和防止植株地上部蒸腾两方面进行，其描述的棉花试管苗直接移栽成活率低的主要原因是移栽环境通气不良，导致根部发霉。采用的方法是将试管苗移栽到消毒基质中防止烂根和加入促生根剂促生根，而没有认识到保护原有根系不受损对于维持移栽后棉花试管苗吸收平衡的重要性，也没有认识到保持移栽前后温度，光照，湿度条件不变的即保持试管苗代谢平衡的重要性，尤其是罩在试管苗上的不透气的一次性塑料杯，虽然可以避免染菌和防止植株地上部蒸腾，但打破了移栽前植株的生理代谢平衡。前10天湿度过大，易导致试管苗发育迟缓，缓苗时间长。10天后逐渐放苗，塑料杯开口的大小不易掌握，湿度不易控制，易出现缓苗时间长和试管苗脱水萎蔫死亡的可能。该移栽方法不能实现全苗移栽成活，对于棉花稀缺遗传材料试管苗的保存具有一定风险。

而目前广泛采用的嫁接的方法，需要保持砧木和接穗部位直径一致性和砧木和接穗苗龄的一致性，并对操作者的嫁接技术要求较高，同时该类研究也未对嫁接环境进行严格控制，同样存在操作繁琐，移栽与缓苗受环境影响的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简便、缓苗时间短、移栽成活率高的棉花试管苗的移栽方法。

本发明采用如下技术方案：

一种高成活率的棉花试管苗移栽方法，其包括如下步骤：

（1）将棉花试管苗从培养基中慢慢取出，防止根系断落；

（2）将棉花试管苗直接移栽到温室内的地里或花盆内，温度控制在23℃-25℃；

（3）在离棉花试管苗8cm以外的四周，缓缓浇水，浇透；

（4）取无底的透明瓶，将棉花试管苗罩在瓶内，瓶口用封口膜封上；

（5）每3天浇一次水，保持土壤湿润即可；

（6）生长3周后，去掉封口膜；

（7）再过1周后，撤掉透明瓶，可将移栽植株放到大田正常生长。

进一步的，所述试管苗为棉花幼胚苗或棉花组培再生苗。

进一步的，所述棉花幼胚苗为胚龄20天以上，且长度达到7mm以上的幼胚培养发育的棉花幼胚苗，棉花幼胚苗具有完整的根系，两片子叶可以打开。

进一步的，所述棉花组培再生苗为苗龄达到3叶1心以上的、有完整的根系的棉花组培再生苗。

进一步的，所述温室为日光温室或光照培养室。

进一步的，所述温室的光照强度为2000-5000lx。

进一步的，所述透明瓶为2.5l的圆形或方形的去底透明塑料瓶。

进一步的，所述封口膜为组培用封口膜。

本发明的有益效果在于：

1、移栽前，试管苗需要有完整的叶片和根系，如幼胚苗需要2片子叶能够正常展开，组培再生苗需要达到3叶一心，试管苗在试管中能够维持正常的生理代谢平衡。

2、从培养基中小心取出试管苗，保持了试管苗原有根系完整性。

3、通过控制环境温度，在试管苗上罩透明塑料瓶保持光照，在瓶口上封具有透气功能的封口膜来控制湿度，保持试管苗移栽前后环境条件不改变，维持试管苗正常的生理代谢平衡。该方法的移栽成活率达到100%，具有操作简便，缓苗时间短等优点。适用于已生根的棉花体细胞培养再生植株，幼胚培养再生植株，依赖于组织培养转基因再生植株，以及远缘杂交和遗传作图群体等资源材料组培再生植株移栽成活和保存。

附图说明

图1棉花幼胚苗的控温见光保湿处理图。

图2棉花幼胚苗移栽后生长效果图。

图3棉花茎尖组培再生苗的控温见光保湿处理图。

图4棉花茎尖组培再生苗移栽后生长效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的高成活率的棉花试管苗移栽方法，进行进一步详细说明。

实施例1

供试材料：以陆地棉常规品种快育66，冀棉958，冀棉298的幼胚苗作为供试材料。

方法与步骤：如图1和图2所示，将2片子叶展开有根系的棉花幼胚苗从培养基中缓慢取出，注意一定不要伤到根系，放入日光温室或光照培养室里挖好的土坑中，一手轻轻捏住棉茎，使棉苗直立起来，另一只手在根上轻轻覆土，浇适量自来水。将去底的2.5l的透明塑料瓶直接罩在棉花幼胚苗上，瓶口用封口膜封住。将环境温度控制在23-25℃之间，光照强度为2000-5000lx。待棉花幼胚苗长至5叶一心（约三周后），撤去封口膜，7天后，撤去2.5l的透明塑料瓶，棉花幼胚苗全部移栽成活，成活率达100%。

实施例2

供试材料：以陆地棉常规品系13n66的茎尖组织再生苗作为供试材料。

方法与步骤：如图3和图4所示，将3叶1心且有根系的棉花茎尖组织再生苗从培养基中缓慢取出，注意一定不要伤到根系，放入日光温室或光照培养室里挖好的土坑中，将环境温度控制在23-25℃之间，光照强度为2000-5000lx。一手轻轻捏住棉茎，使棉苗直立起来，另一只手在根上轻轻覆土，浇适量自来水。将去底的2.5l的透明塑料瓶直接罩在棉花茎尖组织再生苗上，瓶口用封口膜封住。待棉花茎尖组织再生苗长至7叶一心（约三周后），撤去封口膜，7天后，撤去2.5l的透明塑料瓶，棉花茎尖组织再生苗全部移栽成活，成活率达100%。

对比例1

以快育66，冀棉958，冀棉298的棉花幼胚苗为实验材料比较遮荫保湿处理、见光保湿处理及控温见光保湿处理的移栽效果，方法步骤如下：

1、遮荫保湿处理：将棉花幼胚苗从培养基中缓慢取出，注意一定不要伤到根系，放入挖好的土坑中，一手轻轻捏住棉茎，使棉苗直立起来，另一只手在根上轻轻覆土，浇适量自来水。将黑色遮阴网折叠成双层，以20cm的竹签作为支撑，用遮阴网遮住胚苗。每天白天分两次向遮阴网喷水，保持胚苗湿润，相对湿度维持在90%以上，环境温度保持在20℃-35℃之间。三批次试验，观察移栽成活情况。

2、见光保湿处理：将棉花幼胚苗直接移栽到土中，操作步骤同遮荫保湿处理移栽入土步骤，将去底的2.5l的透明塑料瓶直接罩在棉花幼胚苗上，瓶口用封口膜封住。环境温度保持在20℃-35℃之间。三批次试验，观察移栽成活情况。

3、控温见光保湿处理：在见光保湿处理的操作步骤基础上，将环境温度控制在23-25℃之间，3周后去掉封口膜，再过一周，去掉塑料瓶。三批次试验，观察移栽成活情况。试验结果见表1。

表1不同温光湿处理方法对棉花幼胚苗移栽成活的影响

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结果表明，控温见光保湿处理在上述品种棉花幼胚苗的移栽比较试验中效果最好，移栽成活率达到100%，缓苗时间小于1天；展开子叶的棉花幼胚苗，12小时后就可观察到长出的新芽，基本不存在缓苗时间。遮荫保湿处理，棉花幼胚苗存活了7天，由于见光少，幼胚苗从绿色逐渐变为浅黄色，生长停滞，第8天出现腐烂变质现象，10天后全部腐烂死亡。未控温的见光保湿处理，在白天当温度超过30℃即开始叶片变软萎蔫，超过35℃很快萎蔫死亡。

温度、湿度、光照是维持棉花正常生理代谢的主要外部环境条件。棉花幼胚苗及组培再生苗的发育，一直是在弱光恒温恒湿条件下进行的，植株和根系的水分代谢和吸收能力相对较弱。当改变此环境条件时，棉花植株本身脆弱的代谢平衡很容易被打破，从而导致脱水萎蔫死亡。

对比例1比较了三种温光湿处理的移栽方法对棉花幼胚苗的影响，目的是想找出一个操作简便，适宜棉花幼胚苗，组培苗，转基因再生苗移栽成活的新方法。遮荫保湿处理仅能保证棉花试管苗的温度与湿度条件，但由于缺少光照，长时间的高湿环境，容易造成试管苗的黄化和腐烂。见光保湿处理，仅控制光照和湿度条件，但没有控制环境温度，当环境温度超过35℃时，棉花试管苗迅速萎蔫死亡。控温见光保湿处理则是通过控制温度，光照，湿度三个环境条件来保持移栽前后棉花试管苗环境条件不变，以维持试管苗正常的生理代谢平衡。这也是该方法移栽成活高，不存在缓苗的主要原因。

对比例2

以快育66、冀棉958和冀棉298的棉花幼胚苗为供试材料，采用控温见光保湿处理，比较了15d、20d、25d和30d胚龄的棉花幼胚苗移栽处理效果（表2），结果表明，上述3个品种的棉花幼胚在胚龄达到20d以上，且幼胚长度达到7mm以上时，组织培养可以获得2片子叶展开发育良好的棉花幼胚苗，这样的棉花幼胚苗移栽可以成活。

表2不同胚龄的棉花幼胚苗对移栽成活的影响

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对比例3

以13n66不同苗龄的棉花茎尖组培再生苗为供试材料，采用控温见光保湿处理进行移栽，表3结果表明，已生根的达到3叶1心以上的棉花组培再生苗移栽容易成活，不存在缓苗过程。2叶1心的棉花组培再生苗，缓苗时间较长，一般需要缓苗10天左右，同时，有少量死亡现象。低于1叶1心的棉花组培再生苗，不仅缓苗时间长，而且在长时间缓苗过程中存在组培再生苗真菌污染大量死亡的情况。特别需要注意，由于棉花组培再生苗的根系多为须根根系，在移栽过程中易断，所以在移栽过程中，棉花组培再生苗从培养基内取出时，要尽量轻柔慢慢地从培养基中取出，尽量保持根系不断，不要冲洗，直接移栽到土中。根系损伤越小，缓苗时间也就越短。即便如此，移栽过程中还是容易出现根系断落的现象，少量的根系断落，组培再生苗仍能成活，但存在一定的缓苗时间。随着植株根系断落数量的增加，缓苗时间也会变得越来越长，当根系全部断落时，转基因再生苗仍有移栽成活的可能，但出现霉变、萎蔫、死亡的可能也大大增加。

表3不同苗龄的组培再生植株对移栽成活的影响

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特别需要注意，由于棉花组培再生苗的根系多为须根根系，在移栽过程中易断，所以在移栽过程中，棉花组培再生苗从培养基内取出时，要尽量轻柔慢慢地从培养基中取出，尽量保持根系不断，不要冲洗，直接移栽到土中。根系损伤越小，缓苗时间也就越短。即便如此，移栽过程中还是容易出现根系断落的现象，少量的根系断落，组培再生苗仍能成活，但存在一定的缓苗时间。随着植株根系断落数量的增加，缓苗时间也会变得越来越长，当根系全部断落时，转基因再生苗仍有移栽成活的可能，但出现霉变、萎蔫、死亡的可能也大大增加。

由对比例2和对比例3可以知道，温度、光照及湿度等外部条件确定后，棉花组培苗发育是否健全，是影响棉花组培苗移栽成活的又一关键因素。如果在棉花幼胚培养时选择的棉花幼胚胚龄偏小，或者胚龄虽然够了，但是幼胚在棉桃中发育不良，幼胚体积太小，长度小于7mm，容易导致棉花幼胚苗的子叶发育不良，两片子叶不能正常打开，或者根系发育不良。棉花体细胞组培再生苗的移栽也同样要求植株发育健全，棉花再生苗在培养皿中未长出的真叶或植株底部不能再生出根系，这些发育不正常的棉花组培苗都会在移栽后因为不能维持正常的生理代谢平衡而导致移栽失败。真叶数和植株根系越少，维持代谢平衡的能力就越弱，移栽时就越容易受到微弱环境的影响，移栽成活率就越低。棉花幼胚苗子叶和根系发育正常的植株，体细胞组培再生苗的真叶数达到3叶以上且有根系时，移栽时容易成活，不存在缓苗时间。

棉花组培苗的移栽过程中根系能否完整保存，也是影响移栽转化成活率的又一重要影响因素。由于组培苗的再生根系，多为须根，根系容易从再生苗上脱落，所以将组培苗从培养基中取出时，需要格外轻柔和小心，不要水洗，防止根系断落。在蛭石盒中培养的组培再生植株，需要水慢慢没过整盒蛭石，待根系在水的作用下与塑料盒壁慢慢分离，然后轻轻将组培苗的根系从水中慢慢提出，这样可以在最大限度保持根系完整性，从而保证移栽的成活。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，但并不限于此，本领域的技术人员很容易根据上述实施例领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本发明的精神，都在本发明的保护范围之内。