本发明技术属于金鱼人工诱导育种技术领域,具体涉及一种人工诱导雌核发育金鱼的体色性状纯种系培育方法。
背景技术：
金鱼（carassiusauratus）是目前国内观赏鱼市场中最普遍的消费品种，市场上常见的体色有红色、红白、黄色、五花等，但能稳定遗传的品系不多。因此，开展金鱼体色定向发育的遗传研究，不仅大幅度缩短优质品色选育的时间、提高育种效率，还能创造新的经济价值，具有广阔的实用前景。
据研究资料：国外在斑马鱼、孔雀鱼、青鳉鱼、月光鱼及日本锦鲤等海洋鱼类、热带观赏鱼类体色选育研究中成就突出。国内也有学者针对鱼类体色开展了相关研究，如张建森等体色体型遗传研究；徐伟等杂交子代的体色和鳞被遗传特性研究；王成辉的体色遗传与变异研究等等。目前，绝大部分仍通过人工调控鱼类体色定向发育以获得特定体色的鱼类，其方法有：遗传因素调控、内分泌因素调控、营养因素调控、着色物质调控、环境控制等。此外，大量研究结果表明，只有纯种系品种体色才能获得稳定的遗传。
如何稳定保持优良金鱼的观赏体色性状已成为观赏金鱼的遗传育种中亟待解决的问题。以雌核发育方法建立金鱼遗传纯系，可以快速选育出观赏体色性状稳定的金鱼纯种系，繁殖出大量具有优良观赏体色性状的金鱼以满足人们的需求，以实现观赏鱼类目标体色性状的定向培育。
技术实现要素：
本发明采用常压室温等离子体育种仪(aｒtp)进行鲫鱼精子灭活处理,其与所选择体色形状雌性金鱼卵受精,采用秋水仙素结合冷处理方式，人工诱导金鱼雌核发育二倍体化，通过目标体色形状金鱼鉴定筛选，选育获得建立目标体色性状的金鱼纯种系，为观赏鱼类目标体色性状的定向培育创建新的快捷途径。
为实现本发明目的而采用技术方案如下：
1、精子失活处理
采用体色为青灰色的雄性鲫鱼,采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（lhｒh－a2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射3～5mg复配催熟剂进行第二次注射。按常规采集鲫鱼精子液,使用40～50倍数的hank's液进行稀释,得到精子稀释液。
所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（dom）、6mg鲤鱼脑垂体（pg）、800国际单位iu人绒毛膜促性腺激素（hcg）。
利用常压室温等离子体的育种仪(aｒtp)分批次对精子稀释液进行精子失活处理，多批次合并后鲫鱼失活精子液总量300μl以上。
精子失活处理后每20μl失活精子液中加入5μl0.6m甘露醇、10μlhank's液，-2～4℃低温避光保存备用。
所述的精子失活处理，其条件为:精子稀释液上样量20μl，处理输出功率125w，气体流速10l·min－1，辐照距离2mm，处理时间为20～60s。
2、受精
在一洁净2l陶瓷盆中，倒入0.5l～1l鱼类生理盐水，在陶瓷盆底面放置已除菌处理好鱼巢，然后挑选2～4龄不同于鲫鱼体色产卵期的雌性金鱼，按雌性金鱼每kg体重注射鲤鱼脑垂体3～4mg比例进行人工催产，之后用手挤净雌性金鱼卵粒于鱼类生理盐水中，同时在挤出金鱼卵粒周围，倒入200μl低温保存鲫鱼失活精子液，并用羽毛在水中轻轻搅动，使精卵在水中完成受精并粘附在鱼巢上。
所述的鱼类生理盐水配方为：nacl15g、kcl0.3g、cacl20.6g、10μl0.6m三磷酸腺苷(atp)、纯净水20g，并调整鱼类生理盐水的ph为7.0。
3、雌核发育二倍体化和孵化
采用秋水仙素结合冷处理方式进行处理金鱼受精卵雌核发育二倍体化。在孵化缸中倒入1升浓度为40～6oppm的秋水仙素水溶液，并降温至-1～3℃温度，再将受精后金鱼卵浸泡在秋水仙素水溶液中，浸泡时间为20～30分钟。浸泡后移至24℃水温的常规孵化池进行雌核发育二倍体化后自然孵化。
4、目标体色性状f1代金鱼筛选
经过雌核发育二倍体化的金鱼卵在孵化池孵化发育生长,经过50～100天体色转变。由于雌性金鱼苗的体色相对于雄性鲫鱼苗的青灰色体色是隐性性状,其杂交后的子一代（f1代）体色是青灰色,只有真实的实现雌核发育二倍体化的金鱼个体，其体色是不同于鲫鱼青灰色体色的。因此，在孵化池中选择弃去青灰色的个体，保留下的原有目标体色性状雌核发育的f1代金鱼个体。
5、建立目标体色性状的f1代金鱼
将目标体色雌核发育的f1代金鱼苗移入育苗池,在生长发育过程中，剔除掉孵化后生长发育过程呈现出一些表达出有害隐性基因控制的性状的个体鱼苗以及因亲本性状不佳而产生畸型或损伤鱼苗，保留选择健康发育的目标体色雌核发育的金鱼苗，继续培育到2～4龄，得到目标体色性状的f1代金鱼个体。
6、目标体色f2代金鱼纯种系的培育
选择2～4龄的目标体色性状的f1代雌性金鱼作为亲鱼，雄性亲鱼采用体色为青灰色的鲫鱼。重复上述技术方案中1-5的步骤，得到健康的具有高遗传率的目标体色性状的f2代金鱼纯种系。采用本发明技术方案得到的目标体色性状的f2代金鱼纯种系亲本用于育种生产,稳定保持优良金鱼的观赏体色性状,繁殖出大量具有优良观赏体色性状的金鱼以满足人们的需求。
本发明所用的促黄体素释放激素类似物（lhｒh－a2）、地欧酮（dom）、鲤鱼脑垂体（pg）、iu人绒毛膜促性腺激素（hcg）、甘露醇、秋水仙素均市场外购。常压室温等离子体育种仪购置于青岛一津测试技术有限公司。
具体实施方式
实施例1
1、精子失活处理
雄鱼采用体色为青灰色的鲫鱼,采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（lhｒh－a2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射5mg复配催熟剂进行第二次注射。按常规采集鲫鱼精子液,使用50倍数的hank's液进行稀释,得到精子稀释液。
所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（dom）、6mg鲤鱼脑垂体（pg）、800国际单位iu人绒毛膜促性腺激素（hcg）。
利用常压室温等离子体的育种仪(aｒtp)分批次重复对精子稀释液进行精子失活处理，合并后鲫鱼失活精子液总量300μl以上；处理后每20μl失活精子液中加入5μl0.6m甘露醇、10μlhank's液，4℃低温避光保存备用。
所述的精子失活处理，其条件为:精子稀释液上样量20μl，处理输出功率125w，气体流速10l·min－1，辐照距离2mm，处理时间为50s。
2、受精
挑选4龄产卵期镏金色体色的雌性金鱼，按雌性金鱼每kg体重注射鲤鱼脑垂体3mg进行人工催产。在一洁净2l陶瓷盆中，倒入1l鱼类生理盐水，在陶瓷盆底面放置已除菌处理好鱼巢，之后用手挤净雌性金鱼卵粒于鱼类生理盐水中，同时在挤出金鱼卵粒周围，倒入200μl低温保存鲫鱼失活精子液，并用羽毛在水中轻轻搅动，使精卵在水中完成受精并粘附在鱼巢上。
所述的鱼类生理盐水配方为：nacl15g、kcl0.3g、cacl20.6g、10μl0.6m三磷酸腺苷(atp)、纯净水20g，并调整鱼类生理盐水的ph为7.0。
3、雌核发育二倍体化和孵化
采用秋水仙素结合冷处理方式进行处理金鱼受精卵雌核发育二倍体化。在孵化缸中倒入1升浓度为6oppm的秋水仙素水溶液，并降温至3℃温度，再将受精后金鱼卵浸泡在秋水仙素水溶液中，浸泡时间为20分钟。浸泡后移至24℃水温的常规孵化池进行雌核发育二倍体化后自然孵化。
4、目标镏金色体色性状f1代金鱼筛选
经过雌核发育二倍体化的金鱼卵在孵化池孵化发育生长,经过80天体色转变。由于雌性金鱼苗的体色相对于雄性鲫鱼苗的青灰色体色是隐性性状,其杂交后的子一代（f1代）体色是青灰色,只有真实的实现雌核发育二倍体化的金鱼个体，其体色是镏金色体色。因此，在孵化池中选择弃去青灰色的个体，保留下的原有目标镏金色体色性状雌核发育金鱼个体为f1代。
5、建立目标镏金色体色性状的f1代金鱼
将目标镏金色体色雌核发育的f1代金鱼苗移入育苗池,在生长发育过程中，不断剔除掉非目标体色雌核发育的金鱼苗，即剔除孵化后生长发育过程呈现出一些表达出有害隐性基因控制的性状的个体鱼苗、有的因亲本性状不佳而产生畸型或损伤鱼苗，保留健康发育的目标镏金色体色雌核发育的金鱼苗，继续培育到4龄，得到目标镏金色体色性状的f1代金鱼。
6、目标镏金色体色f2代金鱼纯种系的培育
选择4龄的目标镏金色体色性状的f1代雌性金鱼作为亲鱼，雄鱼采用体色为青灰色的鲫鱼。重复上述技术方案中1-5的步骤，得到健康的具有高遗传率的目标镏金色体色性状的f2代金鱼纯种系。
采用本实施例得到的目标镏金色体色性状的f2代金鱼纯种系亲本用于育种生产,稳定保持优良金鱼的观赏镏金色体色性状,繁殖出大量具有优良观赏镏金色体色性状的金鱼。
实施例2
1、精子失活处理
雄鱼采用体色为青灰色的鲫鱼,采用二次注射法进行催产排精，第一次用2μg促黄体素释放激素类似物（lhｒh－a2）预备针注射雄性亲鱼；16小时后，按照每kg鱼重注射3mg复配催熟剂进行第二次注射。按常规采集鲫鱼精子液,使用40倍数的hank's液进行稀释,得到精子稀释液。
所述的复配催熟剂，其配方为每10mg复配催熟剂中含有2mg地欧酮（dom）、6mg鲤鱼脑垂体（pg）、800国际单位iu人绒毛膜促性腺激素（hcg）。
利用常压室温等离子体的育种仪(aｒtp)分批次重复对精子稀释液进行精子失活处理，处理后每20μl失活精子液中加入5μl0.6m甘露醇、10μlhank's液，-1℃低温避光保存备用。合并后鲫鱼失活精子液总量300μl以上
所述的精子失活处理，其条件为:精子稀释液上样量20μl，处理输出功率125w，气体流速10l·min－1，辐照距离2mm，处理时间为30s。
2、受精
挑选2龄产卵期的红色雌性金鱼，按雌性金鱼每kg体重注射鲤鱼脑垂体4mg进行人工催产。在一洁净2l陶瓷盆中，倒入1l鱼类生理盐水，在陶瓷盆底面放置已除菌处理好鱼巢，之后用手挤净雌性金鱼卵粒于鱼类生理盐水中，同时在挤出金鱼卵粒周围，倒入200μl低温保存鲫鱼失活精子液，并用羽毛在水中轻轻搅动，使精卵在水中完成受精并粘附在鱼巢上。
所述的鱼类生理盐水配方为：nacl15g、kcl0.3g、cacl20.6g、10μl0.6m三磷酸腺苷(atp)、纯净水20g，并调整鱼类生理盐水的ph为7.0。
3、雌核发育二倍体化和孵化
采用秋水仙素结合冷处理方式进行处理金鱼受精卵雌核发育二倍体化。在孵化缸中倒入1升浓度为40ppm的秋水仙素水溶液，并降温至-1℃温度，再将受精后金鱼卵浸泡在秋水仙素水溶液中，浸泡时间为30分钟。浸泡后移至24℃水温的常规孵化池进行雌核发育二倍体化后自然孵化。
4、目标红色体色性状f1代金鱼筛选
经过雌核发育二倍体化的金鱼卵在孵化池孵化发育生长,经过60天体色转变。由于雌性金鱼苗的体色相对于雄性鲫鱼苗的青灰色体色是隐性性状,其杂交后的子一代（f1代）体色是青灰色,只有真实的实现雌核发育二倍体化的金鱼个体，其体色是不同于鲫鱼青灰色的红色体色。因此，在孵化池中选择弃去青灰色的个体，保留下的原有目标红色体色性状雌核发育金鱼个体为f1代。
5、建立目标红色体色性状的f1代金鱼
将目标红色体色雌核发育的f1代金鱼苗移入育苗池,在生长发育过程中，剔除掉孵化后生长发育过程呈现出一些表达出有害隐性基因控制的性状的个体鱼苗、有的因亲本性状不佳而产生畸型或损伤鱼苗，保留选择健康发育的目标红色体色雌核发育的金鱼苗，继续培育到2龄，得到目标红色体色性状的f1代金鱼。
6、目标红色体色f2代金鱼纯种系的培育
选择2龄的目标红色体色性状的f1代雌性金鱼作为亲鱼，雄鱼采用体色为青灰色的鲫鱼。重复上述技术方案中1-5的步骤，得到健康的具有高遗传率的目标红色体色性状的f2代金鱼纯种系。
采用本实施例得到的目标红色体色性状的f2代金鱼纯种系亲本用于育种生产,稳定保持优良金鱼的观赏红色体色性状,繁殖出大量具有优良观赏红色体色性状的金鱼。