本发明涉及转基因植物环境安全领域，具体涉及一种外源杀虫蛋白对天敌昆虫龟纹瓢虫成虫影响的评价方法及饲喂装置。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌属，是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂之一，它所具有的杀虫活性的主要来源是该菌株体内产生的伴孢晶体蛋白。研究人员将bt基因导入常规作物从而获得表达外源杀虫蛋白的转基因作物，自从1996年首次种植转基因作物以来，转基因作物已在全球得到大面积推广，为全世界的农业生产创造了巨大的经济、社会及环境效益。
转外源杀虫蛋白基因作物在整个生育期都能表达外源杀虫蛋白，可能会使取食转基因作物而存活下来的靶标或非靶标昆虫体内含有不同程度的外源杀虫蛋白，当天敌取食这些体内含有外源杀虫蛋白的昆虫后，外源杀虫蛋白可能会传递给天敌，并对天敌造成一定的影响。外源杀虫蛋白对天敌昆虫的安全性逐渐成为研究人员关注的重点和焦点，也是转基因抗虫植物环境安全评价的主要内容。同时转新型基因材料也不断涌现，其中导入的外源基因的环境安全性存在巨大的差异，要经过科学的评价才能进行下一步环境试验。
农田天敌昆虫种类较多，其中龟纹瓢虫propyleajaponica是优势种之一。由于它分布广，盛夏也能繁殖，在田间取食季节较长，是一种非常优良的天敌资源。龟纹瓢虫属鞘翅目、瓢虫科、龟纹瓢虫属，在我国大部分地区都有分布，捕食麦蚜、棉蚜、玉米蚜等多种蚜虫，并取食稻飞虱、木虱和叶螨等多种植食性害虫，是蚜虫及棉铃虫等害虫的优势天敌。龟纹瓢虫可以通过直接取食植食性昆虫间接暴露于外源杀虫蛋白，另外龟纹瓢虫成虫具有取食植物花外蜜腺的习性，这种习性使得龟纹瓢虫成虫具有直接暴露于外源杀虫蛋白的风险。研究结果表明，龟纹瓢虫可作为转基因作物环境安全检测中的指示性昆虫，并且建立起龟纹瓢虫规范化饲养方法，可以提供整齐一致的供试龟纹瓢虫。
在评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫影响时，一般以对龟纹瓢虫最大暴露量的10倍以上的外源杀虫蛋白来喂食龟纹瓢虫，直接使用转基因植物花粉无法达到上述要求。在以往评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫影响时，植物体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作来影响龟纹瓢虫的风险未被考虑。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法及饲喂装置，该方法建立在评价植物体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作来影响龟纹瓢虫的风险理论之上，借助一种模拟植物腺体的饲喂装置来实现上述目的，更加真实的反映龟纹瓢虫所面临的杀虫蛋白威胁的自然环境，且评价方法简单、适用性强。
本发明首先提供了一种评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置，其特征是，它包括带管盖且底部开口的大离心管、带管盖的小离心管和毛细管；
所述小离心管嵌套在大离心管的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管外3/4以上(管帽及上部在大离心管内)；
所述毛细管的一端穿透小离心管的管盖暴露在小离心管外，另一端伸入到小离心管的底部；
所述大离心管为50-100ml的离心管；所述小离心管为1-5ml的离心管；所述毛细管的内径为0.50-0.55mm。
优选的，所述大离心管为50ml的离心管；所述小离心管为1.5-2.0ml的离心管；所述毛细管的内径为0.53mm。
本发明还公开了一种评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)采集健康非转基因棉花叶片，磨碎后加入1.8-2.2倍叶片质量的无菌蒸馏水，摇床振荡提取，离心，抽取上清，过滤后即为获得的棉花汁液提取物；
(2)以棉花汁液提取物作为溶剂，加入外源杀虫蛋白和果糖，制成果终浓度为0.1-0.5g/ml的待测溶液；同时设不加外源杀虫蛋白的阴性对照液以及采用蛋白酶抑制剂代替外源杀虫蛋白的阳性对照液；
(3)分别将待测溶液、阳性对照液和阴性对照液装入到饲喂装置的小离心管中，盖上管盖，通过伸入到溶液底部的毛细管引流出小离心管中的溶液，截断毛细管，使溶液暴露于管口；然后将小离心管的暴露部分放置恒温装置保持蛋白活性；
(4)将新羽化的龟纹瓢虫成虫根据雌雄随机配对，单对放入到饲喂装置的大离心管中，管开口处用棉花封口，连同恒温装置一起放置于光照培养箱中培养；大离心管中补充足量的豌豆蚜，每2-3天更换一次离心管中的溶液，试验持续18-25d；
(5)试验过程中每天观察记录龟纹瓢虫成虫的存活和产卵情况；试验结束后，将所有存活的龟纹瓢虫成虫辨别雌雄，冷冻干燥后分别称重。
进一步的，在“与阴性对照组相比，阳性对照组的成虫的发育历期显著延长，幼虫死亡率显著升高”的前提下，如果与阴性对照组相比，待测溶液对龟纹瓢虫成虫死亡率、产卵前期、产卵量和体重的指标上均没有显著性差异，则表明：外源杀虫蛋白cry1ac对龟纹瓢虫成虫没有造成不利影响。
优选的，所述步骤(1)的摇床振荡提取为在室温下在200rpm的摇床浸取2h。
优选的，所述步骤(4)光照培养箱中温度为25℃±1℃，湿度为60％-70％，光周期为l:d＝14h:10h。
优选的，所述步骤(4)实验过程中，每一种饲喂溶液视为一个试验处理，每一个试验处理45对龟纹瓢虫。
优选的，所述外源杀虫蛋白为cry1ac，其待测溶液终浓度为20μg/ml，蛋白酶抑制剂为e-64，阳性对照溶液终浓度为400μg/ml。
本发明的有益效果是：
1、本发明评价杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响时，完全考虑到龟纹瓢虫所面临的杀虫蛋白威胁的自然环境，具体如下：1)蚜虫取食植物棉花的叶片，龟纹瓢虫也有取食棉花的花外蜜腺的习性。本发明提取棉花汁液提取物作为溶剂并补充蚜虫作为饲料，不仅模拟了龟纹瓢虫取食花外蜜腺的自然环境，同时也考虑了棉花体内次生代谢物质与杀虫蛋白互作对龟纹瓢虫的影响，因此，更加真实的反映龟纹瓢虫所面临的自然环境；2)本发明设计了一种模拟植物腺体的装置，模拟龟纹瓢虫取食棉花的花外蜜腺的吸取方式，更加真实的反映龟纹瓢虫的取食方式。
2、评价方法中要考虑龟纹瓢虫的正常存活及产卵。本发明采用果糖作为龟纹瓢虫成虫的诱食剂，不仅刺激龟纹瓢虫取食，还可以提高龟纹瓢虫成虫的存活率和产卵量，保证了龟纹瓢虫正常取食以及可以正常用于实验。
3、本发明提供了一种龟纹瓢虫饲喂装置，该装置模拟植物腺体，由嵌套的大小两根离心管和毛细管构成，通过毛细管(内径0.53mm左右)引流喂食龟纹瓢虫成虫，同时还可以进一步通过恒温装置保持蛋白活性。该装置采用实验室常用化学仪器制成，结构简单且非常实用。
附图说明
图1为评价外源杀虫蛋白对龟纹瓢虫成虫影响的饲喂装置图；其中，1、大离心管，2、小离心管；3、毛细管。
图2为饲喂装置放置于恒温装置上的图。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本发明作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本发明的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本发明来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。
如图1所示，上述饲喂装置，包括带管盖且底部开口的大离心管1、带管盖的小离心管2和毛细管3。所述小离心管2嵌套在大离心管1的开口的底部，且小离心管的管体暴露在大离心管1外3/4以上(底部及下部在大离心管外，管帽及上部在大离心管内)；所述毛细管3的一端穿透小离心管2的管盖暴露在小离心管2外，另一端伸入到小离心管2的底部；所述大离心管为50ml的离心管；所述小离心管为1.5-2ml的离心管；所述毛细管的内径为0.53mm。
实施例1：果糖提高龟纹瓢虫成虫的存活率和产卵量
采集健康非转基因棉花叶片100g，研磨后加入200g的无菌蒸馏水，放在容器内，室温下在200rpm的摇床浸取2h，使用离心机12000g离心10min，抽取上清，过滤后即为获得的棉花汁液提取物。
称取0.4g果糖和0.4g蔗糖分别置于2.0ml的离心管中，再加入棉花汁液提取物，定容至1ml，混匀后即为配制好的0.4g/ml的果糖溶液和0.4g/ml的蔗糖溶液。
分别将0.4g/ml的果糖溶液和0.4g/ml的蔗糖溶液分装到1.5ml离心管中，每管250μl，盖上管盖，离心管管盖用锐利物刺孔，插入适宜长度的毛细管(内径0.53mm)至溶液底部，引流出其中的溶液，截断毛细管，使溶液暴露于管口。将上述1.5ml离心管底部朝下从50ml离心管管口，将50ml离心管底部开口，使1.5ml离心管管体能暴露出3/4以上(即制成了如图1所示的饲喂装置)，将暴露部分放置到14℃的恒温金属浴上(如图2)。提前制备时也可以将0.4g/ml的果糖溶液和0.4g/ml的蔗糖溶液提前分装到1.5ml离心管中，每管250μl，-20℃放置，保存时间不超过1个月，使用时再制备成饲喂时的状态。
将新羽化的龟纹瓢虫成虫(羽化12h内)在解剖镜下辨别雌雄，随机配对，单对放入上述50ml的离心管中，离心管开口处用棉花封口。连同恒温金属浴一起放置于光照培养箱中，温度为25℃±1℃，湿度为60-70％，光周期为l:d＝14h:10h。每一种饲喂溶液视为一个试验处理，每一个试验处理45对龟纹瓢虫成虫，离心管中适时补充豌豆蚜作为瓢虫成虫的食物，每天观察并补充足量的豌豆蚜，每两天更换一次1.5ml离心管中的溶液，试验持续20d。
试验过程中每天观察记录龟纹瓢虫成虫的存活和产卵情况。试验结束后，将所有存活的龟纹瓢虫成虫辨别雌雄，冷冻干燥后分别称重。
试验结果如表1所示。从表1可以看出：与0.4g/ml的蔗糖溶液相比，0.4g/ml的果糖溶液饲养的龟纹瓢虫成虫死亡率降低、产卵前期缩短、产卵量增加、体重增加。该结果表明，0.4g/ml的果糖更有利于龟纹瓢虫成虫的存活。
表1.果糖和蔗糖对龟纹瓢虫成虫生物学特性的影响
实施例2：外源杀虫蛋白cry1ac蛋白对龟纹瓢虫影响的评价
采集健康非转基因棉花叶片100g，研磨后加入200g的无菌蒸馏水，放在容器内，室温下在200rpm的摇床浸取2h，使用离心机12000g离心10min，抽取上清，过滤后即为获得的棉花汁液提取物。
称取20μg的外源杀虫蛋白cry1ac和400mg果糖置于2.0ml的离心管中，再加入棉花汁液提取物定容至1ml，混匀后即为配制好的浓度为20μg/ml的外源杀虫蛋白cry1ac溶液，其中含有0.4g/ml的果糖溶液。
称取400μg的蛋白酶抑制剂e-64和400mg果糖置于2.0ml的离心管中，加入棉花汁液提取物作定容至1ml，混匀后即为配制好的含有400μg/ml的蛋白酶抑制剂的阳性对照溶液，其中含有0.4g/ml的果糖溶液。
称取400mg果糖置于2.0ml的离心管中，加入棉花汁液提取物定容至1ml，混匀后即为配制好的阴性对照溶液，其中含有0.4g/ml的果糖溶液。
分别将250μl的外源杀虫蛋白cry1ac溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液装入到1.5ml离心管中，盖上管盖，离心管管盖用锐利物刺孔，插入适宜长度的毛细管(内径0.53mm)至溶液底部，引流出其中的溶液，截断毛细管，使溶液暴露于管口。将上述1.5ml离心管底部朝下从50ml离心管管口，将50ml离心管底部开口，使1.5ml离心管管体能暴露出3/4以上(即制成了如图1所示的饲喂装置)，将暴露部分放置到14℃的恒温金属浴上。
将新羽化的龟纹瓢虫成虫(羽化12h内)在解剖镜下辨别雌雄，随机配对，单对放入上述50ml的离心管中，离心管开口处用棉花封口。连同恒温金属浴一起放置于光照培养箱中，温度为25℃±1℃，湿度为60％-70％，光周期为l:d＝14h:10h。每一种饲喂溶液视为一个试验处理，每一个试验处理45对龟纹瓢虫成虫，离心管中适时补充豌豆蚜作为瓢虫成虫的食物，每天观察并补充足量的豌豆蚜，每两天更换一次1.5ml离心管中的溶液，试验持续20d。
试验过程中每天观察记录龟纹瓢虫成虫的存活和产卵情况。试验结束后，将所有存活的龟纹瓢虫成虫辨别雌雄，冷冻干燥后分别称重。
试验结果如表2所示。与阴性对照组相比，阳性对照溶液处理组的成虫的发育历期显著延长，幼虫死亡率显著升高，符合阳性对照的实验预期。与阴性对照组相比，外源杀虫蛋白cry1ac对龟纹瓢虫成虫死亡率、产卵前期、产卵量和体重的指标上均没有显著性差异。该结果表明，外源杀虫蛋白cry1ac对龟纹瓢虫成虫没有造成不利影响。
表2.cry1ac蛋白对龟纹瓢虫成虫生物学特性的影响
综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，因此，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。