本发明涉及植物栽培
技术领域：
，特别涉及一种提高铁皮石斛甘露糖含量的方法。
背景技术：
：石斛，在《神农本草经》中就列为上品，并载：“石斛—味甘平。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳，羸瘦，强阴。久服厚肠胃，轻身延年。”2010年版《中国药典》开始把铁皮石斛从多来源石斛药材中分出单独成项。铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛dendrobiumofficinalekimuraetmigo的茎；味甘、性微寒，具有益胃生津、滋阴清热之功，用于热病津伤、口干烦渴、食少干呕、胃阴不足、病后虚热不退、阴虚火旺、骨蒸劳热、目暗不明、筋骨痿软等。铁皮石斛的主要有效成分为铁皮石斛多糖，但其组分复杂，结构鉴定困难，组成铁皮石斛多糖的单糖主要有甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及鼠李糖等；在铁皮石斛叶、花中组成多糖的单糖组成成分略有不同，主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸及阿拉伯糖等5种单糖组成；但组成铁皮石斛多糖的单糖成分都是以甘露糖的含量比例为最高。目前有报道人工栽培提高铁皮石斛中甘露糖含量的方法，如公布号为cn107371718a的中国专利公开了一种提高铁皮石斛甘露糖含量的方法，并采用以下方法进行栽培：s1.选择生长旺盛和没有封顶的健壮瓶苗，对出瓶后的种苗进行漂洗、消毒和晾干处理后进行移栽定植；s2.在经浸泡消毒后的基质上挖好苗穴，将苗根捋顺移栽在苗穴内，盖上基质，用1000～1500倍的多菌灵溶液对叶面进行喷施消毒，在移栽3天后喷施500～800倍的植物活力素，使基质表层湿透；在移栽后的1周内，保持基质的湿度和遮光率；s3.移栽一周后进入幼苗管理期，幼苗期管理分为3个阶段：(1)第一阶段：移栽后的7～15天保持遮光率为90％，光照的强度为5000～10000lux，以喷水雾的方式使空气湿度保持在85～90％rh；(2)第二阶段：移栽后的15～30天保持遮光率为80％，光照的强度为10000～15000lux，喷水雾使空气湿度保持在70～80％rh，并施一次缓释肥；(3)第三阶段：移栽30天后1次/周叶面喷施1500倍复合肥，保持遮光率为70％，光照的强度为15000～20000lux，喷水雾使空气湿度保持在70～80％rh；s4.过了幼苗期的铁皮石斛开始进行季节管理分为春季管理、夏季管理、秋季管理和冬季管理，包括遮阳、通风、浇水、施肥和保温，同时当出现病虫害时，对其施加农药治理；s5.用酒精消毒的工具采收跨年生长的老茎，将采摘的铁皮石斛茎带叶清洗后室温晾干，在23～27℃条件下浸泡在复合消毒液中，再将晾干的铁皮石斛带叶鲜条放进冷库，控制温度在4～6℃，低温处理15～20天，得到甘露糖的铁皮石斛。6-苄基氨基嘌呤(6-ba，cas号：1214-39-7)是人工合成的细胞分裂素。具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解，保绿防老；将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用在农业、果树和园艺作物从发芽到收获的各个阶段。目前尚未有应用6-苄基氨基嘌呤提高铁皮石斛中甘露糖含量的方法的报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种提高铁皮石斛中甘露糖含量的方法。为实现上述目的，本发明提供了一种提高铁皮石斛中甘露糖含量的方法，其特征在于，所述方法为：连续3～6个月每隔10～30天向铁皮石斛喷施6-苄基氨基嘌呤溶液，停止喷施6-苄基氨基嘌呤溶液后，继续种植5～11个月后采摘。优选地，连续4～5个月每隔10～30天向铁皮石斛喷施6-苄基氨基嘌呤溶液。优选地，继续种植5个月后采摘。优选地，所述铁皮石斛作遮蔽处理。优选地，所述铁皮石斛作遮蔽处理，使遮蔽度为30％～80％。优选地，所述铁皮石斛作遮蔽处理，使遮蔽度为50％～70％。优选地，所述铁皮石斛作遮蔽处理，使遮蔽度为70％。优选地，所述铁皮石斛为盆种铁皮石斛。优选地，所述铁皮石斛为三年生盆种铁皮石斛、二年生盆种铁皮石斛、一年生种盆铁皮石斛。优选地，所述铁皮石斛为三年生盆种铁皮石斛、二年生盆种铁皮石斛。优选地，所述6-苄基氨基嘌呤溶液浓度为3.0～7.0mg/l。优选地，所述6-苄基氨基嘌呤溶液浓度为5.0mg/l。优选地，每隔10～20天向铁皮石斛喷施6-苄基氨基嘌呤溶液。优选地，每隔15天向铁皮石斛喷施6-苄基氨基嘌呤溶液。优选地，所述铁皮石斛为三年生盆种铁皮石斛、二年生盆种铁皮石斛，停止喷施6-苄基氨基嘌呤溶液后，继续种植5个月后采摘。优选地，采摘部位为二年生盆种铁皮石斛二年生枝条、三年生盆种铁皮石斛二年生枝条。本发明还提供6-苄基氨基嘌呤在提高铁皮石斛中甘露糖含量方面的用途。优选地，所述铁皮石斛为盆种铁皮石斛。优选地，所述铁皮石斛为三年生盆种铁皮石斛、二年生盆种铁皮石斛、一年生种盆铁皮石斛。优选地，所述铁皮石斛为三年生盆种铁皮石斛、二年生盆种铁皮石斛。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.6-ba能明显提高二年生盆种铁皮石斛、三年生盆种铁皮石斛中甘露糖的含量。2.6-ba能明显提高二年生盆种铁皮石斛二年生枝条、三年生盆种铁皮石斛二年生枝条的甘露糖含量，效果优于赤霉素、遮蔽度为70％或50％的对照。附图说明图1～图3为甘露糖标准品及内标的色谱峰；a：d-甘露糖，b：pmp，c：d-盐酸氨基葡萄糖；图4～图6为铁皮石斛中甘露含量测定结果；图7为三年生盆种铁皮石斛一、二、三年生枝条鲜药材示例，图中1为一年生枝条，2为二年生枝条；3为三年生枝条；具体实施方式实施例1铁皮石斛的栽培与采收1.一般资料广西产铁皮石斛(容县都峤山品系)通过组织培养方式获得组培苗，栽培于广西中医药大学壮瑶药协同创新中心gap栽培基地(南宁市横县镇龙乡)，采用有机栽培、高架床盆栽模式。三年生盆于2014年1月份移栽(至2017年1月份，盆龄为3年)，二年生盆于2015年1月份移栽(至2017年1月份，盆龄为2年)，一年盆于2016年1月份移栽(至2017年1月份，盆龄为1年)。经广西壮族自治区农业科学院蒙平副研究员鉴定为兰科石斛属(dendrobiumsw.)植物铁皮石斛dendrobiumofficinalekimuraetmigo。2.栽培条件及分组(1)对照组：使用黑色遮阳网，遮蔽度为70％；基质为腐熟松树皮、有机肥料、发酵液；用水及方式为山泉水喷雾；常规管理至取材结束。(2)6-ba组：自2016年9月份开始至2017年1月份，每隔15天喷施5mg/l6-苄基氨基嘌呤(6-ba)溶液；其他种植管理方法同对照组。(3)ga3组：自2016年9月份开始至2017年1月份，每隔15天喷施1mg/l赤霉素(ga3)溶液；其他种植管理方法同对照组。(4)物理组：使用黑色遮阳网，遮蔽度为50％；其他种植管理方法同对照组。3.药材采收铁皮石斛药材分别于2017年6月30日(开花前)、2017年10月3日(开花后)、2017年12月4日(《中国药典》规定采收期)分三批次采收。随机挑选各组植株各3盆，按一年生枝条、二年生枝条、三年生枝条分别采摘，切段并在50℃下烘干，粉碎后用于铁皮石斛甘露糖的含量检测。每一年铁皮石斛新芽都是从去年的枝条上萌发，即三年生盆中铁皮石斛一年生枝条是从二年生枝条上抽出、二年生枝条从三年生枝条上抽出、三年生枝条则抽生自组培苗；二年生盆中铁皮石斛一年生枝条是从二年生枝条上抽出、二年生枝条则抽生自组培苗；一年盆生中铁皮石斛一年生枝条抽生自组培苗。采收情况及样品编号，详见表1～表3。表1第一批药材采收及样品编号表2第二批药材采收及样品编号表3第三批药材采收及样品编号实施例2铁皮石斛中甘露糖含量的测定1.仪器设备agilengt1260infinityhplc(美国，安捷伦科技有限公司)；sartoriussqp型分析天平、sartoriusbsa224s分析天平(德国，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；gilsonpipetmanp1000l/p200l移液器(美国，吉尔森公司)；thermoscientificsorvallst16r实验离心机(美国，赛默飞世尔科技公司)；eppendorfcentrifuge5810r高速冷冻离心机(德国，eppendorf公司)；merckmilliporedirect-q3,5,8纯水/超纯水一体机(德国，默克集团)；labdancers25小舞灵漩涡混合器(德国，ika集团)。2.试剂d-盐酸氨基葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号：140649-201606)；d-甘露糖(中国食品药品检定研究院，批号：140651-201504)；乙腈(色谱纯，美国fisherscientific)；乙酸铵(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；无水乙醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)、甲醇、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷(均为国药集团化学试剂有限公司)；水(一级纯水、二级纯水)。(1)内标液(12mg/ml盐酸氨基葡萄糖)：取3.0gd-盐酸氨基葡萄糖，精密称量，用纯水溶解，定容于250ml容量瓶中，摇匀；(2)0.1mg/ml甘露糖标准品：精密称量10.00mgd-甘露糖置于100ml容量瓶中，再加内标液1ml，纯水溶解后，再定容至刻度，摇匀；(3)0.5mol/lpmp：精密称量43.55gpmp(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)，用甲醇溶解后，转移到500ml容量瓶，定容至刻度，摇匀；(4)0.02mol/l乙酸铵溶液：精称1.5417g乙酸铵，用一级纯水溶解，转移到1000ml容量瓶中，用一级纯水定容至刻度，摇匀。3.方法(1)色谱条件：色谱柱：agilengtzorbaxsb-c18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以乙腈:0.02mol/l乙酸铵溶液(20:80)；柱温：20℃；检测波长为250nm。理论板数以甘露糖峰计算应不低于4000。(2)校正因子测定：精密吸取0.1mg/ml甘露糖标准品溶液400μl，加0.5mol/l的pmp(1-苯基-3-甲基-5-p吡唑啉酮)甲醇液、0.3mol/l的naoh溶液各400μl，混匀，在70℃水浴反应100min；再加人500μl0.3mol/l的hcl溶液，混匀，用氯仿洗涤3次，每次2ml，弃去氯仿层液，水层待离心(转速为8000r/min，10min)后，经0.45μm微孔过滤膜滤过后注入进样瓶，取上清液10μl，注入高效液相色谱仪，待机器运行稳定后，在250nm处检测，测定甘露糖标准品及内标的色谱峰面积，根据峰面积与浓度的比值计算校正因子，f(校正因子)＝(a内标/c内标)/(a甘露糖/c甘露糖)，计算得f＝0.8326，详见表4，图1～图3。表4校正因子计算(n＝3)(3)供试品溶液制备：取各编号样品的广西产铁皮石斛粉末3份(过三号筛)0.12g，精密称定，用滤纸包好后置于索氏提取器中，加适量80％乙醇，水浴加热回流提取4h，弃去乙醇提取液，待药渣挥干乙醇后，拆开滤纸包放于烧杯中，加100ml纯水，再精密加入2ml盐酸氨基葡萄糖内标溶液(连同烧杯、玻璃棒一起称重)，煎煮并时时搅拌1h；放冷后，加纯水补至约100ml并进行恒重，混匀后，取水煎液50ml刻度离心管中离心(转速为8000r/min，10min)；再精密吸取上清液1ml，置于5ml一次性试管中，再加入3.0mol/l的hcl溶液0.5ml，用封口胶封口，混匀后，在110℃水解1h；放冷后，用3.0mol/l、0.3mol/l的naoh溶液适量调ph值至中性；再吸取400μl，参照校正因子测定方法，自“加0.5mol/l的pmp(1-苯基-3-甲基-5-p吡唑啉酮)甲醇液”起，依法操作，经0.45μm微孔过滤膜滤过后注入进样瓶，备用。(4)测定方法：将制备的供试品溶液放入高效液相色谱仪，待机器运行稳定后，在250nm处检测，测定样品中甘露糖及内标的色谱峰面积，根据校正因子及峰面积的比值计算样品中甘露糖的含量，甘露糖的含量的计算公式如下：甘露糖含量(％)＝c甘露糖(mg/ml)×100(ml)/样品量(g)/1000(单位转换倍数)。4.测定结果采用内标hplc法计算出广西产铁皮石斛检测样品浓度后，再用“甘露糖含量(％)”的计算公式算出其甘露糖含量。具体测定结果详见附图4～图6，取3份样品结果的平均值，结果见表5。各年生盆、各批次的比较结果见表6、表7、表8。各枝条的比较结果见表9。表5广西产铁皮石斛甘露糖含量测定结果(％)表6各实验组对各批次广西铁皮石斛甘露糖含量的影响(n＝24，均值％±标准差％)组别第一批第二批第三批对照组16.00±6.0313.28±2.7420.16±5.326-ba组21.07±9.6316.24±5.3715.55±6.69ga3组13.45±7.1813.51±6.4215.87±5.91物理组12.55±7.3718.49±5.4513.22±5.39如表6所示，6-ba能明显提高第一批铁皮石斛中甘露糖的含量，且为各实验组最高，为21.07％±9.63％；而遮蔽度为50％的处理则能明显提高第二批铁皮石斛中甘露糖的含量，遮蔽度为70％的处理能明显提高第三批铁皮石斛中甘露糖的含量。表7各实验组对各年盆广西铁皮石斛甘露糖含量的影响(均值％±标准差％)如表7所示，6-ba能明显提高二年生盆、三年生盆铁皮石斛中甘露糖的含量，且二年生盆铁皮石斛的甘露糖含量为各实验组最高，为21.16％±7.35％。表8各实验组对各年生盆、各批次广西铁皮石斛甘露糖含量的影响(％)如表8所示，6-ba能分别提高第一批二年生盆、三年生盆铁皮石斛中甘露糖的含量，均高于同批次的其他实验组；其中，第一批二年生盆铁皮石斛中甘露糖含量为最高，含量高达25.27％。表9各实验组对第一批次各年生枝条广西铁皮石斛甘露糖含量的影响(n＝3，％)组别对照组6-ba组ga3组物理组一年生盆枝12.58±0.069.06±0.0318.74±0.066.82±0.22二年生盆一年生枝10.12±0.1016.78±0.035.51±0.097.03±0.04二年生盆二年生枝21.56±0.0733.75±0.1215.41±0.0424.73±0.05三年生盆一年生枝12.50±0.0615.30±0.116.59±0.017.67±0.04三年生盆二年生枝25.37±0.5731.40±0.0423.84±0.0518.30±0.09三年生盆三年生枝13.89±0.0120.13±0.1310.61±0.0710.77±0.07如表9所示，6-ba能分别提高铁皮石斛二年生盆二年生枝、三年生盆二年生枝的甘露糖含量，含量均高于30％，且分别高于其他处理组的同年生枝条。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页12