本发明属于鱼类精子冷冻保存
技术领域：
，具体涉及一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液及其冷冻复苏方法和应用。
背景技术：
：泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)以其丰富的营养价值和特有的滋补药用功效而被誉为“水中人参”，深受中国、日本及韩国等地消费者的青睐，是我国新兴起的小型经济鱼类。随着泥鳅养殖业的发展，苗种的需求量与日俱增，特别是人工繁殖的优质苗种紧缺，不能满足市场需求，为此不少学者对泥鳅的人工繁殖进行了研究。然而，在实际生产中人们发现，雄性泥鳅个体小、数量也明显少于雌性泥鳅，这给泥鳅苗种的规模化人工繁殖带来不便。人工保存精子不仅能不间断地为鱼类的规模化苗种繁殖提供配子材料，还能为鱼类的遗传育种研究提供便利。鉴于此，多年来，国内外学者对各种鱼类精液的保存方法进行了大量研究，并取得了一定成功。在泥鳅中，董德孝(2013)和陈金辉&文媛(2016)分别发明了在常温下保存泥鳅精子的方法及相应的保存液，但在常温条件下，通过加入保存液虽然能抑制精子的运动、延长精子的存活时间，但精子的代谢活动并没有完全停止，能量仍在消耗，因此，保存的时间非常有限。在超低温(-196℃)条件下，精子的运动和代谢活动完全停止，精子处于假死状态，但其结构完整，生命以静止状态保存下来，因此是目前长期、有效保存鱼类精子的唯一方法。陈兵(1991)以KCl、葡萄糖、NaHCO3及NaCl为原料制备了大鳞副泥鳅精子冷冻保存的稀释液，并以7.5％的二甲亚砜(DMSO)为抗冻剂，对大鳞副泥鳅的精液进行超低温保存，但复苏后，大鳞副泥鳅精子的存活时间仅1-2min，活动力和受精率均很低。Yasui等(2009)研究了泥鳅精子冷冻保存的稀释液、精子内部冷冻保护剂和外部保护剂、以及冷冻保存方法，但复苏后，精子的受精率只有47％，远低于鲜精的受精率。针对目前泥鳅精子超低温冷冻保存中存在的复苏率低、复苏后受精力差等问题，申请人对泥鳅精子冷冻保存的相关因子进行了系统的研究，经过反复试验，筛选出了一种适合于泥鳅精子的超低温冷冻保存液及冷冻复苏方法。利用该方法对泥鳅的精子进行冷冻保存，复苏后的精子活率高达72.3％。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，获得了近似鲜精的受精率(81.5％)。本方法冻存量大、效果好、简便易行、无需昂贵的仪器设备，能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液，该保存液配制方法简单、便于存贮。本发明的另一个目的在于提供一种泥鳅精子的冷冻复苏方法，利用该方法对泥鳅的精子进行超低温冷冻保存，复苏后的精子活率达72.3％。用复苏后的精子对泥鳅卵受精，受精率达81.5％，孵化率达84.9％，与鲜精没有显著性差异(P＞0.05)。本方法能解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题，为泥鳅苗种的规模化生产和遗传育种研究提供便利。本发明的最后一个目的在于提供了一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液的应用。为了实现上述目的，本发明采取以下技术措施：一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液，包括：450-500mgNaCl，650-700mgKCl，20-25mgCaCl2，10-15mgMgSO4，200-250mgTris，400-600mg甘氨酸，90-92mLddH2O，4-6mL乙二醇，4-6mLDMSO。以上所述的保存液，优选的配制方法为：480mgNaCl，680mgKCl，22mgCaCl2，12mgMgSO4，240mgTris，500mg甘氨酸，90mLddH2O，5mL乙二醇，5mLDMSO。一种泥鳅精子超低温冷冻复苏的方法，其步骤包括：(1)配制冷冻保存液：配置新鲜的上述超低温冷冻保存液，4℃冰箱中预冷；(2)稀释精液：将新鲜泥鳅精液与冷冻保存液按照1:5-1:8的体积比混匀；(3)分装：将稀释后的精液分装至冻存管；(4)程序降温：将冻存管置于程序降温盒(1℃/min)中，再一起移入-80℃冰箱中，停留4-6h；(5)超低温保存：将冻存管放入液氮中长期保存；(6)复苏：将冻存管置于25-32℃水浴中，轻轻摇动使温度均匀，待只剩少量固体时立即取出，在空气中继续摇动使其完全融化。一种泥鳅精子的超低温冷冻保存液的应用，包括利用本发明的冷冻保存液配方制备成泥鳅精子超低温冷冻保存液制剂。与现有技术相比，本发明具有以下优点：目前已有的泥鳅精子保存液及保存方法包括两类：一类是常温保存，在常温条件下，通过加入保存液虽然能抑制精子的运动、延长精子的存活时间，但精子的代谢活动并没有完全停止，能量仍在消耗，因此，保存的时间非常有限；另一类是冷冻保存，但由于对保存液的成分或保存方法等缺乏系统的研究，因此，复苏后精子的活率低、受精力差。与现有技术相比，本发明提供的泥鳅精子超低温冷冻保存液及冷冻复苏方法，不仅操作简便、方法高效、能长期有效地保存泥鳅的精子，而且精子的复苏率高、活性好、具有近似鲜精的受精率(81.5％)，能有效地解决实际生产中泥鳅雄性个体少、精卵适时受精等问题。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。实施例1：泥鳅精子的超低温冷冻保存：(1)制备精液：选择性腺发育良好、体质健壮的6尾雄鳅，用LHRH-A2+DOM混合注射法进行人工催产，达到效应时间后，挤出精液，收集精液与新鲜配置预冷的保存液按照1:6的体积比混匀；(2)分装：将稀释后的精液用0.5mL冻存管分装，每管装0.3mL；(3)程序降温：将冻存管置于程序降温盒(1℃/min)中，再一起移入-80℃冰箱中，停留4-6h；(4)超低温保存：将冻存管放入液氮中长期保存；所述的冷冻保存液，由以下方法配制得到：将480mgNaCl，680mgKCl，22mgCaCl2，12mgMgSO4，240mgTris，500mg甘氨酸溶解于90mLddH2O中；使用前加入5mL乙二醇和5mLDMSO；4℃冰箱中预冷后使用。实施例2：泥鳅精子的超低温冷冻保存的复苏及复苏后的精子活力检测(1)将实施例1中的冷冻保存物冷冻1个月后复苏：将冻存管置于28℃水浴中，轻轻摇动，使温度均匀，待只剩少量固体时立即取出，在空气中继续摇动使其完全融化。(2)精子活力检测在显微镜下进行。取45μL0.6％NaCl溶液于载玻片上，在10×40的倍镜下对准视野，取5μL精液在液滴中混匀，并迅速观察精子的运动情况。统计精子的活率，即被激活的、呈快速直线运动的精子占检测精子总数的百分比；记录精子的寿命，即从被激活开始至90％以上的精子失去运动能力而作原地颤动所经历的时间。用新鲜精巢制备的精液做对照。每个样品重复观察3次。结果如表1所示，复苏后的精子用0.6％NaCl溶液激活后，72.3％的精子能够快速直线运动，其比率稍低于鲜精(90.2％)；但快速运动时间能持续约61S，寿命约为2min5S，与鲜精没有显著性差异(P＞0.05)。表1冷冻复苏精子的活力分析指标冷冻复苏精液新鲜精液P值精子活率(％)72.3±2.690.2±1.80.02快速定向运动持续时间(S)61±566±40.06寿命(min&S)2min5S±5S2min12S±7S0.07实施例3：冷冻复苏后的泥鳅精子在人工繁殖中的应用：(1)选择性腺发育良好、体质健壮的6尾雌鳅，用LHRH-A2+DOM混合注射法进行人工催产，达到效应时间后，挤出卵；(2)选择质量好的卵混合后分成6份。取其中3份滴加复苏后的精液(1-2万卵/mL精液)，加入适量0.6％NaCl溶液混合激活受精，1min后再加入较多的0.6％NaCl溶液洗去保存液中的乙二醇、DMSO和多余的精子。另外3份卵用新鲜的精液授精。所有受精卵均在24-26℃条件下孵化，定期换水、并及时吸出死卵。原肠中期统计受精率，脱膜后统计孵化率。结果如表2所示，结果显示，采用本发明中的冷冻保存液及冷冻复苏方法，精子保留了较强的受精能力，与鲜精相比，冻精的受精率、受精卵的孵化率和鱼苗7日龄存活率没有显著性差异(P＞0.05)。表2同一批卵分别用冻精和鲜精受精的受精率、孵化率和鱼苗7日龄存活率指标冷冻复苏精液新鲜精液P值受精率(％)81.5±2.983.3±2.10.09孵化率(％)84.9±3.286.1±2.60.08鱼苗7日龄存活率(％)95.6±2.798.2±1.80.06当前第1页1 2 3