一种龙珠果组织培养方法与流程

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种龙珠果组织培养方法。

背景技术

龙珠果(passiflorafoetidal.)，又名香花果、天仙果、野仙桃等，为西番莲科西番莲属草质藤本植物。原产于西印度群岛，在我国主要分布于广东、海南、福建和台湾等地，生长于荒山草坡、灌丛或近海边沙滩(王东等，2014)。

龙珠果植株高数米，整株尤其是损伤的叶片常散发出辛辣的味道；茎具条纹且有平展柔毛；叶膜质，表面有柔毛，宽卵形或长圆状卵形，基部心形且有3～5个浅裂，边缘不规则，叶脉羽状；叶柄具平展柔毛；托叶半抱茎，深裂；聚伞花序，花白色或淡紫色，具白斑；苞片3枚；萼片5枚；花瓣5枚；浆果卵圆球形，无毛；种子多数，椭圆形，草黄色；花期7～8月，果期翌年4～5月(中国植物志，1999)。龙珠果花朵秀丽，颜色多变，具有一定的观赏价值；果实外形美观，香甜可食，具有一定的经济价值；全株可入药，具有一定的药用价值。

龙珠果中主要含有黄酮类化合物，其主要成分有牡荆素、异牡荆素、荭草素、异荭草素等(中华本草，1999)。龙珠果具有清热解毒、清肺止咳之功效，临床多用于治疗肺热咳嗽、小便混浊、痈疮肿毒、外伤性眼角膜炎、淋巴结炎等症(姬生国等，2012；中国植物志，1999)。国外研究表明，龙珠果提取物在治疗酒精、尼古丁、吗啡及大麻酚的药物成瘾性方面疗效较好(sasikala等，2011；sathish等，2011)。果实可用作催吐剂、用果实煎煮可用于治疗哮喘；叶片外敷可治疗创伤，干燥的叶片泡茶有助于解决睡眠问题；根可用于调经并且对治疗过度兴奋和暴躁有作用(deshaprabhu，1966；krishnaveni和thaakur，2008)。

组织培养具有快速、大量、遗传稳定性好等优点。利用组织培养技术进行植物快速繁殖有利于解决种子来源稀少或种子萌发困难植物的繁殖问题、挽救珍稀濒危物种、解决药用植物野生资源短缺等问题。目前，国内学者对龙珠果的研究主要集中在成分测定、药理作用等方面，组织培养相关的研究报道较少。国外虽有龙珠果组织培养相关的研究，但所用的外植体多见于龙珠果种子、茎段等部位，未见以龙珠果叶片为外植体诱导体胚和不定芽的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种操作性强、繁殖效率高、增值系数大、能用于工厂化生产的龙珠果组织培养方法，通过该方法可以对龙珠果进行大量、快速繁殖。

本发明包括两种龙珠果组织培养方法，分别是以叶片诱导体胚、诱导体胚和不定芽的龙珠果组织培养方法。

本发明的以叶片诱导体胚的龙珠果组织培养方法，包括以下步骤：

a.外植体的准备：取龙珠果叶片，经消毒后，将叶片切块作为外植体；

b.诱导体胚：将外植体接入体胚诱导培养基培养，诱导出体胚；

所述的体胚诱导培养基：每升含有2,4-d0.5～3.0mg、tdz0.05～0.15mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的ms培养基，ph5.7～5.8；

c.体胚萌发：将体胚转接到体胚萌发培养基培养，得到萌发的体胚；

所述的体胚萌发培养基：每升含有6-ba1.5～2.5mg、naa0.15～0.25mg、ga30.5～1.5mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的ms培养基，ph5.7～5.8；

d.植株再生培养：将萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，获得龙珠果幼苗；

所述的植株再生培养基：每升含有iba0.05～0.2mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的1/2ms培养基，ph5.7～5.8；

e.炼苗及移栽：将龙珠果幼苗炼苗，移栽，进行培养管理，得到龙珠果植株。

优选，所述的步骤a的消毒是将龙珠果叶片用无菌水清洗2～3次，然后用体积分数75％乙醇水溶液将叶片正反面擦拭后，再用无菌水清洗2～3次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡3～5min，最后用无菌水冲洗4～5次。

优选，所述的步骤b的将外植体接入体胚诱导培养基培养，是将外植体以叶片近轴面朝上的方式接入体胚诱导培养基培养。

优选，所述的步骤b、c、d中的培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。

优选，所述的步骤e的炼苗及移栽，是当龙珠果幼苗长至8～10cm高时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗7～10d；然后取出龙珠果幼苗并将根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，适时浇水。

本发明的以叶片诱导体胚和不定芽的龙珠果组织培养方法，包括以下步骤：

a.外植体的准备：取龙珠果叶片，经消毒后，将叶片切块作为外植体；

b.诱导体胚和不定芽：将外植体接入体胚和不定芽诱导培养基培养，诱导出体胚和不定芽；

所述的体胚和不定芽诱导培养基：每升含有2,4-d0.5～3.0mg、6-ba0.5～3.0mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的ms培养基，ph5.7～5.8；

c.体胚萌发：将体胚转接到体胚萌发培养基培养，得到萌发的体胚；

所述的体胚萌发培养基：每升含有6-ba1.5～2.5mg、naa0.15～0.25mg、ga30.5～1.5mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的ms培养基，ph5.7～5.8；

d.植株再生培养：将步骤b诱导的不定芽或步骤c得到的萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，获得龙珠果幼苗；

所述的植株再生培养基：每升含有iba0.05～0.2mg、琼脂6.0～7.0g、蔗糖20～30g和余量的1/2ms培养基，ph5.7～5.8；

e.炼苗及移栽：将龙珠果幼苗炼苗，移栽，进行培养管理，得到龙珠果植株。

优选，所述的步骤a的消毒是将龙珠果叶片用无菌水清洗2～3次，然后用体积分数75％乙醇水溶液将叶片正反面擦拭后，再用无菌水清洗2～3次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡3～5min，最后用无菌水冲洗4～5次。

优选，所述的步骤b的将外植体接入体胚和不定芽诱导培养基培养，是将外植体以叶片近轴面朝上的方式接入体胚和不定芽诱导培养基培养。

优选，所述的步骤b、c、d中的培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。

优选，所述的步骤e的炼苗及移栽，是当龙珠果幼苗长至8～10cm高时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗7～10d；然后取出龙珠果幼苗并将根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，适时浇水。

所述的ms培养基是指本领域已知配方的通用培养基，其成份和配置方法见murashiget,skoogf(1962)arevisedmediumforrapidgrowthandbioassaywithtobaccotissuecultures.physiolplant15:473-497；1/2ms培养基是ms培养基中大量元素减半，而其它成分不变的培养基。

本发明选用幼嫩、健壮、长势基本一致的龙珠果叶片作为外植体，经消毒后得到污染率极低、伤害较小的外植体。消毒成功的外植体在不同配方的诱导培养基中诱导得到体胚、体胚和不定芽等不同产物，将体胚转接到体胚萌发培养基中继续培养得到萌发的体胚，经植株再生培养、移栽等过程得到长势良好的龙珠果植株。本发明的以叶片诱导体胚的龙珠果组织培养方法具有增殖系数大、数量大、出苗多的特点。本发明具有取材方便、材料利用率高、数量多、操作简单、适用于工厂化生产等优点，建立了以龙珠果叶片为外植体的组织培养快繁体系，为开展龙珠果快速繁殖提供育苗技术。

本发明的优点：

1、与传统种子繁殖相比，本方法可以快速、大量获得龙珠果种苗。而且方法简便、操作性强、适用于工厂化生产。

2、本发明方法中，采用叶片作为外植体，大大增加了材料利用的可能性。

3、本方法由叶片诱导出的体胚具有数量多的特点，大大提高了繁殖的速度和数量。

4、本方法采用的消毒方法简化了传统的消毒步骤，而且污染率极低，使操作效率得到很大提高。

5、本方法中组培苗经移栽后成活率高、长势良好，可应用于生产中。

附图说明

图1是叶片诱导出体胚，标尺为2mm。

图2是体胚萌发，标尺为2mm。

图3是植株再生培养的龙珠果幼苗。

图4是驯化后得到的龙珠果植株。

图5是叶片诱导出体胚和不定芽，标尺为5mm。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：诱导体胚的组织培养方法(1)

(1)外植体的准备

供试材料龙珠果为生长三个月约12cm高的实生苗，由种子播种培养而来。选取幼嫩、健壮、长势基本一致的龙珠果叶片作为外植体，置于自来水下冲洗干净，然后用无菌水清洗3次。将清洗过的叶片置于超净工作台上，先用蘸有体积分数75％乙醇水溶液的棉球将叶片正反面擦拭一遍，再用无菌水清洗3次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡3min，最后用无菌水冲洗5次。将消毒过的叶片切成1cm×1cm左右的小方块作为外植体。

(2)诱导体胚

将外植体接入体胚诱导培养基中，叶片近轴面朝上，体胚诱导培养基配方：每升含有2,4-d0.5mg、tdz0.05mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养一周左右叶片部分部位开始变黄，叶片边缘上卷，叶片表面微微鼓起；10d左右叶片皱缩更加明显，叶片整体变黄；20d左右叶片部分部位有瘤状凸起；40d左右叶片表面长满体胚(图1)。

(3)体胚萌发

将经叶片诱导出的体胚转接到体胚萌发培养基培养。体胚萌发培养基配方：每升含有6-ba2.5mg、naa0.25mg、ga31.5mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养40d左右体胚萌发(图2)。

(4)植株再生培养

将萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，植株再生培养基配方：每升含有iba0.2mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的1/2ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。获得龙珠果幼苗长势良好、没有玻璃化现象、根系发达，生根率为95％(图3)。

(5)炼苗及移栽

当龙珠果幼苗形成的植株长至8cm时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10d，然后从组培瓶中取出幼苗，用自来水将幼苗根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，浇透水，保持适当通风，移栽后龙珠果植株生长良好(图4)，成活率达94％。

实施例2：诱导体胚的组织培养方法(2)

(1)外植体的准备

供试材料龙珠果为生长三个月约8cm高的实生苗，由种子播种培养而来。选取幼嫩、健壮、长势基本一致的龙珠果叶片作为外植体，置于自来水下冲洗干净，然后用无菌水清洗2次。将清洗过的叶片置于超净工作台上，先用蘸有体积分数75％乙醇水溶液的棉球将叶片正反面擦拭一遍，再用无菌水清洗2次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗4次。将消毒过的叶片切成1cm×1cm左右的小方块作为外植体。

(2)诱导体胚

将外植体接入体胚诱导培养基中，叶片近轴面朝上，体胚诱导培养基配方：每升含有2,4-d3.0mg、tdz0.15mg、琼脂7.0g、蔗糖20g和余量的ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养一周左右叶片部分部位开始变黄，叶片边缘上卷，叶片表面微微鼓起；10d左右叶片皱缩更加明显，叶片整体变黄；20d左右叶片部分部位有瘤状凸起；40d左右叶片表面长满体胚。

(3)体胚萌发

将经叶片诱导出的体胚转接到体胚萌发培养基培养。体胚萌发培养基配方：每升含有6-ba1.5mg、naa0.15mg、ga30.5mg、琼脂7.0g、蔗糖20g和余量的ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养40d左右体胚萌发。

(4)植株再生培养

将萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，植株再生培养基配方：每升含有iba0.05mg、琼脂7.0mg、蔗糖20g和余量的1/2ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。获得龙珠果幼苗长势良好、没有玻璃化现象、根系发达，生根率为94％。

(5)炼苗及移栽

当龙珠果幼苗形成的植株长至10cm时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗7d，然后从组培瓶中取出幼苗，用自来水将幼苗根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，浇透水，保持适当通风，移栽后龙珠果植株生长良好，成活率达92％。

实施例3：诱导体胚和不定芽的组织培养方法(1)

(1)外植体的准备

供试材料龙珠果为生长三个月约12cm高的实生苗，由种子播种培养而来。选取幼嫩、健壮、长势基本一致的龙珠果叶片作为外植体，置于自来水下冲洗干净，然后用无菌水清洗3次。将清洗过的叶片置于超净工作台上，先用蘸有体积分数75％乙醇水溶液的棉球将叶片正反面擦拭一遍，再用无菌水清洗3次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡3min，最后用无菌水冲洗5次。将消毒过的叶片切成1cm×1cm左右的小方块作为外植体。

(2)诱导体胚和不定芽

将外植体接入体胚和不定芽诱导培养基中，叶片近轴面朝上，体胚和不定芽诱导培养基配方：每升含有2,4-d3.0mg、6-ba3.0mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养一周左右叶片部分部位开始变黄，叶片边缘上卷，叶片表面微微鼓起；10d左右叶片皱缩更加明显，叶片整体变黄；20d左右叶片部分部位有瘤状凸起；40d左右叶片表面长满体胚及不定芽，体胚数量居多(图5)。诱导出的不定芽可直接转接到植株再生培养基培养。

(3)体胚萌发

将经叶片诱导出的体胚转接到体胚萌发培养基培养。体胚萌发培养基配方：每升含有6-ba2.5mg、naa0.25mg、ga31.5mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养40d左右体胚萌发。

(4)植株再生培养

将步骤(2)诱导的不定芽或步骤(3)得到的萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，植株再生培养基配方：每升含有iba0.2mg、琼脂6.0g、蔗糖30g和余量的1/2ms培养基，ph5.7。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。获得龙珠果幼苗长势良好、没有玻璃化现象、根系发达，生根率约为95％。

(5)炼苗及移栽

当龙珠果幼苗形成的植株长至10cm时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗7d，然后从组培瓶中取出幼苗，用自来水将幼苗根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，浇透水，保持适当通风，移栽后龙珠果植株生长良好，成活率约为92％。

实施例4：诱导体胚和不定芽的组织培养方法(2)

(1)外植体的准备

供试材料龙珠果为生长两个半月约8cm高的实生苗，由种子播种培养而来。选取幼嫩、健壮、长势基本一致的龙珠果叶片作为外植体，置于自来水下冲洗干净，然后用无菌水清洗2次。将清洗过的叶片置于超净工作台上，先用蘸有体积分数75％乙醇水溶液的棉球将叶片正反面擦拭一遍，再用无菌水清洗2次，然后用加有终浓度为质量分数0.02％的tween-20的质量分数0.1％的hgcl2溶液浸泡5min，最后用无菌水冲洗4次。将消毒过的叶片切成1cm×1cm左右的小方块作为外植体。

(2)诱导体胚和不定芽

将外植体接入体胚和不定芽诱导培养基中，叶片近轴面朝上，体胚和不定芽诱导培养基配方：每升含有2,4-d0.5mg、6-ba0.5mg、琼脂7.0g、蔗糖20g和余量的ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养一周左右叶片部分部位开始变黄，叶片边缘上卷，叶片表面微微鼓起；10d左右叶片皱缩更加明显，叶片整体变黄；20d左右叶片部分部位有瘤状凸起；40d左右叶片表面长满体胚及不定芽，体胚数量居多。诱导出的不定芽可直接转接到植株再生培养基培养。

(3)体胚萌发

将经叶片诱导出的体胚转接到体胚萌发培养基培养。体胚萌发培养基配方：每升含有6-ba1.5mg、naa0.15mg、ga30.5mg、琼脂7.0g、蔗糖20g和余量的ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。培养40d左右体胚萌发。

(4)植株再生培养

将步骤(2)诱导的不定芽或步骤(3)得到的萌发的体胚转接到植株再生培养基培养，植株再生培养基配方：每升含有iba0.05mg、琼脂7.0g、蔗糖20g和余量的1/2ms培养基，ph5.8。培养条件为温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12h/d。获得龙珠果幼苗长势良好、没有玻璃化现象、根系发达，生根率约为96％。

(5)炼苗及移栽

当龙珠果幼苗形成的植株长至8cm时，将培养瓶打开瓶盖后转移到自然光下炼苗10d，然后从组培瓶中取出幼苗，用自来水将幼苗根部的培养基冲洗干净，种植于将泥炭土：蛭石：珍珠岩以体积比2:1:1混匀得到的基质中，浇透水，保持适当通风，移栽后龙珠果植株生长良好，成活率约为92％。