一种复合抗菌剂的制备方法及应用与流程

本发明属于食品抗菌剂制备领域，具体涉及一种复合抗菌剂的制备方法及应用。

背景技术：

近些年，在市场上流通的抗菌剂种类繁多，然而大部分都含有有毒化学试剂，如次氯酸、过氧乙酸、戊二醛等，使用时存在一定的安全隐患。在这样的背景下，食品安全领域需要一种天然安全，并且具有广谱抗菌性的抗菌剂。

墨角兰(origanummajorana)为多年生草本，喜爱阳光充足、温暖湿润的环境，广泛分布于地中海地区。墨角兰气味芳香，带有甜松和柑橘的香味，是菜肴中常用的香辛料。茎和叶均含有挥发油，主要成分为百里香酚(thymol)和香荆芥酚(carvacrol)。此外，墨角兰其性温，味微苦，具有补气提神，驱毒健脾，止咳平喘，助消化，消胀气，解痉挛的作用。墨角兰天然安全无毒副作用，对各种食源性病原菌及院内感染病原菌均具有一定的抗菌性能，然而，墨角兰对部分细菌的抗菌性能较弱，如肉毒梭状芽孢杆菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。此外，通过传统水提法及醇提法获得的墨角兰提取物存在提取效率低，资源浪费严重，安全性能低等缺点。脉冲磁场技术是一种新型的破胞促提技术，具有温和、高效、无任何副作用的特点，用来提取墨角兰安全可靠，同时不会破坏墨角兰的有效成分。

由于墨角兰生长环境及种植要求的约束，年产量少，获取成本高。因此，尝试制备一种复合抗菌剂，不仅可以降低成本，而且可以提高抗菌剂的抗菌性能，达到协同抗菌的效果。双乙酸钠是一种性质稳定、价格低廉的新型食品添加剂，被美国食品和药品管理局(fda)定位安全物质，具有高效防霉、防腐、保鲜的功能；日柏醇为一种天然抗菌物质，提取自于贝壳、蟹壳、虾壳、鱼骨及昆虫等动物壳体，具有安全性高，适用范围广等优点；聚赖氨酸盐酸盐从淀粉酶产色链霉菌(streptomycesdiastatochromogenes)受控发酵培养液经离子交换树脂吸附、解吸、提纯而来，可作为防腐抗菌剂用于水果、蔬菜、肉及肉制品、小麦粉及其制品、豆类、调味品、饮料等。

目前国内还没有关于墨角兰的相关专利申请。因此开发墨角兰提取物制成的抗菌剂，将会具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的技术缺陷，如：墨角兰获取成本高，传统方法提取率低，资源浪费严重，对部分细菌抗菌性能弱等，本发明提供了一种复合抗菌剂的制备方法。

本发明的具体制备方法，包括以下步骤：

(1)墨角兰提取物的制备：

将墨角兰叶片清洗干净，剪切、烘干，加入无水乙醇浸泡，振摇浸提；然后置于脉冲磁场仪中进行脉冲磁场处理，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物；

(2)复合抗菌剂的制备：

将墨角兰提取物，双乙酸钠，日柏醇，聚赖氨酸盐酸盐和无菌蒸馏水混合，得到复合抗菌剂。

步骤(1)中，所述振摇浸提的温度为25℃，所述振摇浸提时间为24h；

步骤(1)中，所述脉冲磁场处理时，温度为4～25℃，脉冲强度为1.0～5.0t，脉冲数为10～50；

步骤(2)中，所述复合抗菌剂的成分，按质量分数计，墨角兰提取物1.0％-6.0％，双乙酸钠0.1％-1.0％，日柏醇0.5％-2.0％，聚赖氨酸盐酸盐0.1％-0.5％，余量为无菌蒸馏水。

本发明还提供了一种复合抗菌剂的应用，所述复合抗菌剂用于水果蔬菜及肉类的贮藏保鲜。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

(1)脉冲磁场技术具有作用温和，破胞高效，无副作用等特点，本发明通过脉冲磁场技术来提取墨角兰的主要成分，能够有效提高提取效率，减少资源浪费，提高墨角兰提取物安全性。如实施例3所示，乙醇提取率为40.42％，通过脉冲磁场作用后，提取率提高到98.13％。

(2)本发明将墨角兰提取物与双乙酸钠、日柏醇、聚赖氨酸盐酸盐、无菌蒸馏水按照一定比例混合制备复合抗菌剂，不仅能够降低复合抗菌剂的制备成本，而且可以提高复合抗菌剂的抗菌性能。

(3)与墨角兰提取物相比，本发明制备的复合抗菌剂对食源性病原菌及院内感染病原菌具有显著的抗菌效果。具体体现在墨角兰提取物的最小抑菌浓度为0.25％～1.0％，最小杀菌浓度为0.5％～1.0％。而复合抗菌剂有更小的最小抑菌浓度(0.0625％～0.25％)和最小杀菌浓度(0.125％～0.5％)。

(4)本发明制备的复合抗菌剂在水果蔬菜及肉类的应用中具有良好的抗菌效果，如圣女果、鸡肉中的应用。如实施例4中，将复合抗菌剂应用在圣女果中，与墨角兰提取物相比，复合抗菌剂处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的总菌落数明显下降，杀菌效果明显，杀菌率达到了89.41％和95.61％。

(5)本发明将墨角兰提取物与多种天然安全抗菌物质按比例混合，制备复合抗菌剂，提高了复合抗菌剂的抗菌活性，能够有效抑制食源性病原菌及院内感染病原菌的生长繁殖，预防细菌性食物中毒，加强食品安全性，延长食品货架期。

附图说明

图1为本发明的复合抗菌剂对圣女果中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果；

图2为本发明的复合抗菌剂对鸡肉中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1

实验材料：

(1)墨角兰提取物的制备：

称取20g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用80ml无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h；然后置于脉冲磁场仪中，温度为4℃，脉冲强度为1.0t，脉冲数为10，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物。

(2)复合抗菌剂的制备：

将墨角兰提取物，双乙酸钠，日柏醇，聚赖氨酸盐酸盐，无菌蒸馏水按照下述比例混合，得到复合抗菌剂。

所述复合抗菌剂各成分的质量分数如下所示：

本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的40.42％提升到64.19％，得到了更深入有效的墨角兰提取物。本发明将墨角兰提取物作为主要抗菌成分，双乙酸钠、日柏醇和聚赖氨酸盐酸盐作为辅助成分制备复合抗菌剂，安全、无毒副作用。其中，双乙酸钠为一种性质稳定、价格低廉的新型食品添加剂，具有高效防霉、防腐、保鲜的功能；日柏醇为天然物质提取物，来自于贝壳、蟹壳、虾壳、鱼骨及昆虫等动物壳体，安全性高，适用范围广；聚赖氨酸盐酸盐从淀粉酶产色链霉菌(streptomycesdiastatochromogenes)受控发酵培养液中提纯而来，可作为防腐抗菌剂用于水果、蔬菜、肉及肉制品、豆类、调味品等。

该复合抗菌剂可应用于食品保鲜，以及食品设备、环境、加工人员的卫生等方面清洁和消毒，从而有效保障食品及加工环境的安全性，延长食品货架期。

实施例2

(1)墨角兰提取物的制备：

称取20g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用80ml无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h；然后置于脉冲磁场仪中，温度为12℃，脉冲强度为2.5t，脉冲数为25，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物。

(2)复合抗菌剂的制备：

将墨角兰提取物，双乙酸钠，日柏醇，聚赖氨酸盐酸盐，无菌蒸馏水按照一定的比例混合，得到复合抗菌剂。

所述复合抗菌剂各成分的质量分数如下所示：

本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的40.42％提升到78.36％，得到了更深入有效的墨角兰提取物。本发明将墨角兰提取物作为主要抗菌成分，双乙酸钠、日柏醇和聚赖氨酸盐酸盐作为辅助成分制备复合抗菌剂，安全、无毒副作用。该抗菌剂可应用于食品保鲜，以及食品设备、环境、加工人员的卫生等方面清洁和消毒，从而有效保障食品及加工环境的安全性，延长食品货架期。

实施例3

(1)墨角兰提取物的制备：

称取20g墨角兰叶片，清洗干净，剪切、烘干，用80ml无水乙醇浸泡，其中墨角兰叶片与无水乙醇的质量体积之比为2：8，放置于25℃水浴摇床中振摇浸提24h；然后置于脉冲磁场仪中，温度为25℃，脉冲强度为5.0t，脉冲数为50，过滤，浓缩，得到墨角兰提取物。

(2)复合抗菌剂的制备：

将墨角兰提取物，双乙酸钠，日柏醇，聚赖氨酸盐酸盐，无菌蒸馏水按照一定的比例混合，得到复合抗菌剂。

所述复合抗菌剂各成分的质量分数如下所示：

本发明通过脉冲磁场的破胞促提作用，提取率由乙醇提取的40.42％提升到98.13％，得到了更深入有效的墨角兰提取物。本发明将墨角兰提取物作为主要抗菌成分，双乙酸钠、日柏醇和聚赖氨酸盐酸盐作为辅助成分制备复合抗菌剂，安全、无毒副作用。该抗菌剂可应用于食品保鲜，以及食品设备、环境、加工人员的卫生等方面清洁和消毒，从而有效保障食品及加工环境的安全性，延长食品货架期。

实施例4

本实施例采用实施例3中的复合抗菌剂各成分配比进行实验及结果分析，但不仅局限于此。

所述复合抗菌剂各成分的质量分数如下所示：

(一)复合抗菌剂对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌及杀菌效果

(1)实验菌株(菌种名为斜体)

a.食源性病原菌:

大肠杆菌：escherichiacoliifo；

金黄色葡萄球菌：staphyloccocusaureus；

肠炎沙门氏菌：salmonellaenteritidis；

枯草芽孢杆菌：bacilluscereus；

枯草杆菌：bacillussubtilis；

单核细胞增生李斯特菌：listeriamonocytogenes；

肉毒梭状芽孢杆菌：clostridiumbotulinum。

b.院内感染病原菌:

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌：mrsa(methicillin-resistantstaphylococcusaureus)。

(2)实验方法

向无菌营养肉汤(nb)培养液中分别添加复合抗菌剂和墨角兰提取物，使其质量分数分别为0.0625％，0.125％，0.25％，0.5％，1.0％(w/v)。用微量移液器加入培养至对数期的菌液，初始浓度为10^5-6cfu/ml。接种的培养液置于37℃培养箱中培养24～48h，其中单核细胞增生李斯特菌置于25℃培养箱中培养48h。

最小抑菌浓度(minimuminhibitoryconcentration，mic)指在特定环境下孵育后，用肉眼辨别不出细菌繁殖的最小浓度。将大于等于最小抑菌浓度的培养液分别用接种环蘸取一环，在无菌na培养基上划线，同样置于37℃及25℃培养箱中培养24～48h。在营养琼脂(na)培养基上完全看不到菌落生长的浓度定为最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration，mbc)。

(3)实验结果

表1列出了复合抗菌剂及其主要成分墨角兰提取物对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌及杀菌效果，具体体现在最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。墨角兰提取物对各种病原菌的最小抑菌浓度为0.25％～1.0％，最小杀菌浓度为0.5％～1.0％。同时，复合抗菌剂对各种病原菌的最小抑菌浓度为0.0625％～0.25％，最小杀菌浓度为0.125％～0.5％。由此可知，复合抗菌剂具有比墨角兰提取物更良好的抗菌性能，能够有效预防食源性病原菌及院内感染病原菌的污染，保障食品安全。

表1复合抗菌剂对食源性病原菌及院内感染病原菌的抑菌及杀菌效果

(二)复合抗菌剂在圣女果中的应用

(1)实验菌株(菌种名为斜体)

大肠杆菌：escherichiacoli；

金黄色葡萄球菌：staphyloccocusaureus；

(2)实验方法

采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)为模式菌种，测定复合抗菌剂在圣女果中的应用。

购买新鲜圣女果，洗净，切丁。将圣女果与磷酸缓冲液(pbs)以质量比1：9混合，转移至无菌均质袋，均质5min，过滤，吸取上清液，即得质量分数10％(w/w)的圣女果培养液，等体积分装试管，高压灭菌后备用。将复合抗菌剂与墨角兰提取物以最终质量分数为0.50％(w/v)的浓度添加到试管中，并接入培养至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初始浓度为10³cfu/ml，以不添加样品的试管为空白对照组，混合均匀，放置在37℃的摇床培养。在0h，24h，48h，72h，96h时，取出试管，逐级稀释涂布于na培养基上，测定残存菌数。测定方法按照gb4789.2—2010食品卫生微生物学检测菌落总数进行。

(3)实验结果

从图1可以看出，在圣女果培养液中，培养96h后，空白对照组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌迅速生长繁殖，由3.01logcfu/ml增长至7.93logcfu/ml。同样培养96h后，经过墨角兰提取物处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长受到了一定的抑制作用，菌落总数缓慢增加至3.91logcfu/ml及3.61logcfu/ml。在复合抗菌剂处理的圣女果培养液中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的繁殖得到了强烈的抑制，残存菌数分别为0.84logcfu/ml和0.32logcfu/ml，杀菌率达到了89.41％和95.61％。因此，复合抗菌剂表现出更强烈的抗菌作用，在实际使用中能够有效抑制细菌繁殖，保障食品安全。

(三)复合抗菌剂在鸡肉中的应用

(1)实验菌株(菌种名为斜体)

大肠杆菌：escherichiacoli；

金黄色葡萄球菌：staphyloccocusaureus；

(2)实验方法

采用平板菌落计数法，以大肠杆菌(escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)为模式菌种，测定复合抗菌剂在鸡肉中的应用。

购买新鲜鸡肉，洗净，切丁。将鸡肉与磷酸缓冲液(pbs)以质量比1：9混合，转移至无菌均质袋，均质5min，过滤，吸取上清液，即得质量分数10％(w/w)的鸡肉培养液，等体积分装试管，高压灭菌后备用。将复合抗菌剂和墨角兰提取物以最终质量分数为0.50％(w/v)的浓度添加到试管中，并接入培养至对数期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，初始浓度为10³cfu/ml，以不添加样品的试管为空白对照组，混合均匀，放置在37℃的摇床培养。在0h，24h，48h，72h，96h时，取出试管，逐级稀释涂布于na培养基上，测定残存菌数。测定方法按照gb4789.2—2010食品卫生微生物学检测菌落总数进行。

(3)实验结果

由图2可以看出，在鸡肉培养液中，培养96h后，空白对照组的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌迅速繁殖，总菌落数由3.11logcfu/ml增加至8.03logcfu/ml。在墨角兰提取物组，细菌的生长繁殖得到了一定程度的抑制。在96h时，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落数分别为4.24logcfu/ml和4.08logcfu/ml。在复合抗菌剂处理的鸡肉培养液中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长均受到了强烈的抑制，细菌总量急剧减少，残存菌数为1.23logcfu/ml和0.76logcfu/ml，由此计算可得杀菌率为84.68％和90.54％。因此，复合抗菌剂在鸡肉中具有更为显著的杀菌效果，能够有效预防细菌性食物中毒，保障食品安全性，延长食品货架期。