一种番杏组织培养快速繁殖方法与流程

本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种番杏组织培养快速繁殖方法。

背景技术：

番杏(tetragoniatetragonioides)系番杏科(aizoaceae)番杏属(tetragonia)肉质草本，目前主要分布在江苏、浙江、福建、广东、云南等地。其使用方法也呈现一定的地域性，在云南主要作为一种传统草药，清热解毒、祛风消肿，在广东地区则多作为一种野生蔬菜，药食同源，治疗肠炎、败血症等。现代研究表明，番杏具有很好的抗癌、消炎、免疫调节、降血脂等功效。

利用植物外植体在固体培养基上培养，获得愈伤组织或完整植株，即为植物组织培养，也称离体培养或外植体培养。由于不同类型的植物在离体培养所需要的培养条件及方法等方面存在很大的不同，根据具体的植物，调整培养基类型、培养光照及温度、不同培养阶段培养基生长调节剂配比，分别诱导不定芽的形成，在此基础上建立有效的芽繁殖体系和植株再生体系。目前运用植物组织培养技术开展植物的保护和繁殖在很多植物种上已获得成功。

但是，到目前为止，番杏的组织培养方面的研究，国内报道很少，且本研究与前人的研究有很多不同。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能在短期内获得大量番杏栽培苗的番杏组织培养快速繁殖方法。

本发明的番杏组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：

s1、无菌苗的获取：将番杏(tetragoniatetragonioides)种子进行消毒处理，将消毒处理后的番杏种子接种于萌发培养基中，培养条件为22～28℃，光照强度为50～60μmolm^-2s^-1，光照12～13h/d，直至长出无菌苗，所述的萌发培养基为：每升含有6-苄氨基嘌呤1.0～3.0mg，其余成份为ms培养基，ph为5.9；

s2、不定芽的诱导：将无菌苗的茎段作为外植体，将外植体进行消毒处理，将消毒处理后的外植体接种于诱导培养基中培养，培养条件为22～28℃，光照强度为50～60μmolm^-2s^-1，光照12～13h/d，直至诱导出不定芽，所述的诱导培养基为：每升含有n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲0.5～1.0mg或6-苄氨基嘌呤1.0mg，α-萘乙酸0.1mg或吲哚-3-丁酸0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9；

s3、继代增殖：将不定芽转入增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养条件为22～28℃，光照强度为50～60μmolm^-2s^-1，光照12～13h/d，继代增殖得到的不定芽能用于生根培养或者继续继代增殖，所述的增殖培养基为：每升含有6-苄氨基嘌呤0.5～2.0mg和α-萘乙酸0.1～0.3mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9；

s4、生根培养：将继代增殖得到的不定芽转入生根培养基中，培养条件为22～28℃，光照强度为50～60μmolm^-2s^-1，光照12-13h/d，使不定芽生根，长成组培苗，所述的生根培养基为：每升含有吲哚-3-丁酸1.0～2.0mg或α-萘乙酸0.5mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9；

s5、组培苗移栽：将组培苗移植到栽培基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养后获得栽培苗。

所述的将组培苗移植到栽培基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养后获得栽培苗具体为：将组培苗移植到栽培基质中，置于相对湿度为50～70％、透光率为40～50％、20～25℃的环境下培养，期间每星期施用1‰的复合肥一次，获得栽培苗；所述复合肥中n:p:k的质量比为1:1:1。

优选，所述的将番杏(tetragoniatetragonioides)种子进行消毒处理是将番杏(tetragoniatetragonioides)种子用自来水洗净，先以体积分数为75％的酒精水溶液表面擦洗消毒10s，然后无菌水冲洗2次，再在质量分数为0.1％的升汞水溶液中浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次。

优选，所述的将无菌苗的茎段作为外植体，将外植体进行消毒处理，将消毒处理后的外植体接种于诱导培养基中培养是将无菌苗的茎段作为外植体，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗脱2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基中培养。

所述的栽培基质优选为泥炭土、蛭石和河沙按体积比为1:2:1～2混合的混合基质；或者优选为泥炭土和蛭石按体积比为1:2混合的混合基质；或者优选为泥炭土和河沙按体积比1:2混合的混合基质。

本发明中的ms培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法可参看谭文澄、戴策刚主编，《观赏植物组织培养技术》，北京：中国林业出版社，1991。1/2ms培养基是将ms培养基中的大量元素和微量元素减半，其它成分不变而形成的培养基。

由于番杏是肉质草本，且直接采集茎段外植体消毒较为困难。因此本发明将番杏种子消毒后诱导出的无菌苗茎段作为外植体，用于诱导不定芽，效果十分理想。将灭菌消毒的番杏种子接种于萌发培养基中，大概30d就可以获得完整的无菌苗植株。将带位点的茎段接种于诱导培养基中，大概20d就可以诱导出不定芽，转为继代增殖，一般20d就可以继代一次。将不定芽转入生根培养基中，20d就可以生根形成组培苗，组培苗移栽至基质中一般一个月就可以长至5～6cm高，获得栽培苗。

由于番杏的组培苗很小，一般不超过3cm，在移栽到室外后很容易失水死亡。因此本发明将组培苗移栽至混合基质(混合基质为泥炭土、珍珠岩和河沙按体积比为1:2:1～2混合的混合基质；或者为泥炭土和珍珠岩按体积比为1:2混合的混合基质；或者为珍珠岩和河沙按体积比1:2混合的混合基质)中，置于湿润、荫蔽的环境下培养，浇水，施肥以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，保证组培苗有较高的成活率。

本发明中的培养基，除了萌发培养基是ms培养基外，其余均是1/2ms培养基，此举可大量减少番杏组织培养过程中的玻璃化现象。

与现有的技术相比，本发明具有以下优点：

本发明从种子萌发获得无菌苗到获得栽培苗只需要90d，大大加快了番杏的繁殖速度，通过继代增殖，每个月可以增殖10.33倍左右，因此可以在短时间内获得大量的组培苗，组培苗经过移栽后，其成活率高达86％，从而能够使番杏这传统的中草药和新型的蔬菜能都更好的发展，为今后更进一步利用该物种奠定良好的基础。

本发明方法操作简单，易于实施，所用的培养基和试剂易配置，成本低，易大范围推广。

附图说明：

图1为番杏的组织培养；a：番杏无菌苗的培养；b：番杏茎段培养20天左右，形成的芽丛；c：茎段在增殖培养基上增殖；d：在3/4ms培养基上诱导，部分玻璃化的芽丛；e：番杏茎段在ph5.9的增殖培养基上培养20天左右形成的芽丛；f：芽苗在生根培养基上培养20天左右，根系形成；g：生根培养基中芽苗的根系；h：番杏组培苗移栽至混合基质中。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

s1、无菌苗的获取：从中国科学院华南植物园采集的番杏(tetragoniatetragonioides)植株种子，将番杏种子用自来水洗净，先以体积分数为75％的酒精水溶液表面擦洗消毒10s，然后无菌水冲洗2次，再在质量分数为0.1％的升汞水溶液中浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次，最后将其接种于萌发培养基中，培养条件为22～26℃，光照强度为55μmolm^-2s^-1，光照12h/d，30d后获得无菌苗(见图1a)；萌发培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)1.0mg，其余成份为ms培养基，ph为5.9。

s2、不定芽的诱导：以无菌苗的茎段为外植体，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗脱2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为22～26℃，光照强度为55μmolm^-2s^-1，光照12h/d的条件下培养20d后诱导出不定芽(见图1b)；诱导培养基为：每升培养基中含有n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲(tdz)1.0mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s3、继代增殖：将不定芽转入增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养条件为22～26℃，光照强度为55μmolm^-2s^-1，光照12h/d，20天为一个继代周期，每个继代周期增殖9.76倍(见图1c-e)；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)0.5mg、α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s4、生根培养：将继代增殖得到的不定芽转入生根培养基中，培养条件为22～26℃，光照强度为55μmolm^-2s^-1，光照12h/d，使其生根，20d后长成组培苗(见图1f-g)；生根培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)1.0mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s5、组培苗移栽：将组培苗移植到泥炭土、珍珠岩和河沙按体积比为1:2:1混合的混合基质中(见图1h)，置于湿润、遮荫(相对湿度为50～70％，透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(n：p：k为1：1：1)一次)，以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后组培苗长到6cm高，获得栽培苗，成活率高达85％。

实施例2：

s1、无菌苗的获取：从中国科学院华南植物园采集的番杏(tetragoniatetragonioides)植株种子，将番杏种子用自来水洗净，先以体积分数为75％的酒精水溶液表面擦洗消毒10s，然后无菌水冲洗2次，再在质量分数为0.1％的升汞水溶液中浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次，最后将其接种于萌发培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照12h/d，30d后获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg，其余成份为ms培养基，ph为5.9。

s2、不定芽的诱导：以无菌苗的茎段为外植体，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗脱2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照12h/d的条件下培养20d后诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲(tdz)0.5mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s3、继代增殖：将不定芽转入增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照12h/d，22天为一个继代周期，每个继代周期增殖10.33倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)1.0mg、α-萘乙酸(naa)0.2mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s4、生根培养：将继代增殖得到的不定芽转入生根培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照12h/d，使其生根，22d后长成组培苗；生根培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)2.0mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s5、组培苗移栽：将组培苗移植到珍珠岩和河沙按体积比为1:2混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为50～70％，透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(n：p：k为1：1：1)一次)，以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后组培苗长到5～6cm高，获得栽培苗，成活率高达86％。

实施例3：

s1、无菌苗的获取：从中国科学院华南植物园采集的番杏(tetragoniatetragonioides)植株种子，将番杏种子用自来水洗净，先以体积分数为75％的酒精水溶液表面擦洗消毒10s，然后无菌水冲洗2次，再在质量分数为0.1％的升汞水溶液中浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次，最后将其接种于萌发培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为60μmolm^-2s^-1，光照12h/d，30d后获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg，其余成份为ms培养基，ph为5.9。

s2、不定芽的诱导：以无菌苗的茎段为外植体，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗脱2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为23～28℃，光照强度为60μmolm^-2s^-1，光照12h/d的条件下培养20d后诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有n-苯基-n′-1，2，3-噻二唑-5-脲(tdz)0.5mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s3、继代增殖：将不定芽转入增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养条件为23～28℃，光照强度为60μmolm^-2s^-1，光照12h/d，20天为一个继代周期，每个继代周期增殖10.12倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg、α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s4、生根培养：将继代增殖得到的不定芽转入生根培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为60μmolm^-2s^-1，光照12h/d，使其生根，20d后长成组培苗；生根培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)1.5mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s5、组培苗移栽：将组培苗移植到泥炭土和珍珠岩按体积比为1:2混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为50～70％，透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(n：p：k为1：1：1)一次)，以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后组培苗长到5～6cm高，获得栽培苗，成活率高达80％。

实施例4：

s1、无菌苗的获取：从中国科学院华南植物园采集的番杏(tetragoniatetragonioides)植株种子，将番杏种子用自来水洗净，先以体积分数为75％的酒精水溶液表面擦洗消毒10s，然后无菌水冲洗2次，再在质量分数为0.1％的升汞水溶液中浸泡8min，然后用无菌水冲洗3次，最后将其接种于萌发培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照13h/d，30d后获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg，其余成份为ms培养基，ph为5.9。

s2、不定芽的诱导：以无菌苗的茎段为外植体，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗脱2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为23～28℃，光强为50μmolm^-2s^-1，光照13h/d的条件下培养20d后诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)1.0mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s3、继代增殖：将不定芽转入增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养条件为23～28℃，光强为50μmolm^-2s^-1，光照13h/d，20天为一个继代周期，每个继代周期增殖9.86倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)1.0mg、α-萘乙酸(naa)0.3mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s4、生根培养：将继代增殖得到的不定芽转入生根培养基中，培养条件为23～28℃，光照强度为50μmolm^-2s^-1，光照13h/d，使其生根，20d后长成组培苗；生根培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸(naa)0.5mg，其余成份为1/2ms培养基，ph为5.9。

s5、组培苗移栽：将组培苗移植到泥炭土、河沙和珍珠岩按体积比为1:2:2混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为50～70％，透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(n：p：k为1：1：1)一次)，以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后组培苗长到5cm高，获得栽培苗，成活率高达82％。