本发明属于农林领域的药用植物生物技术，具体涉及一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法。
背景技术：
金线莲（anoectochilusroxburghii）即花叶开唇兰，别名金蚕、金线兰、金石松、金线虎头蕉、金线入骨消等，是兰科开唇兰属的一种多年生草本植物；其叶片圆盾形，表面黑棕色，下面暗红色，绒布状明显，有金色网状叶脉名为“金线”，叶基部鞘状包茎形成鞘节，质厚实挺拔似莲，因而得名金线莲。金线莲性喜阴凉、潮湿，尤其喜欢生长在有常绿阔叶树木的沟边、石壁、土质松散的潮湿地带，一般分布在海拔300~1200米的丘陵地。我国多在福建、广东、广西、台湾、四川、贵州、云南等省分布。金线莲是珍稀的药用植物，具有多种显著的药用价值和保健功效。金线莲素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，全草入药，在民间治疗范围较广，具有清热凉血、祛风利湿、解毒、止痛、平衡阴阳、扶正固本，阴阳互补、生津养颜、调和气血、五脏、养寿延年等功效，主治咯血、支气管炎、肾炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、风湿性关节炎、急慢性肝炎、重症肌无力等病症。近年来的研究表明，金线莲含有挥发油、多糖、黄酮、苷类化合物、甾体化合物、有机酸、三萜类、生物碱、核苷类、氨基酸、微量元素等其他多种成分，其中多糖、黄酮、挥发油被认为是金线莲药效的重要成分，具有增强机体免疫力、保肝抗癌的作用。正是由于金线莲对疾病的治疗及养生保健具有良好的效果，其市场需求量巨大，开发前景极为广阔。
在自然条件下，金线莲对生长环境的要求极为苛刻，常零星分布于植被完整、相对湿度高、腐殖质丰厚的林下地表层，而且金线莲种子不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌共生下，才促进种子萌发生长，但发芽率非常低，因此野生资源更新非常缓慢。在早期市场上金线莲的货源主要来自于野生采挖，长期的挖采使其自然生长环境遭受严重破坏，进而导致了野生金线莲种群数量急剧减少。近年来，金线莲人工栽培面积迅速扩大，用来弥补野生金线莲的不足。但是人工栽培的种源大多来自于野生资源，不同种源的金线莲其株高、地径、叶长、植株鲜重等形态学性状以及多糖、黄酮等化学成分均存在差异，以致产量与内在质量不稳定，严重影响了药材的质量。
优良的种质资源不仅是提高中药材质量的关键和源头，还是金线莲品种选育与改良的物质基础。因此开展金线莲种质资源评价研究，并对收集的种质资源加以妥善保存和利用，有利于发掘和利用金线莲优良遗传性状，是推动金线莲产业发展的一项重要工作。目前，金线莲的组织培养技术日趋成熟，在此基础上可以开展种质资源的离体保存。种质离体保存即种质试管苗保存，该方法具有许多优点：首先，植物的生长都在人为控制的环境下进行，这使植物免受病虫及环境气候条件的选择，从而保持一定的基因稳定性；其次，通过离体培养，可以在短期内在数量上形成一定的规模，可以随时用于品种改良与育种研究；其三，离体培养材料体积小，且不携带病菌，因而有利于在国家或地区间进行运输与交流。目前金线莲种质的试管苗保存方法尚未建立，因此开展对金线莲生长特性以及组培繁殖的深入研究，探索建立保存时间久、种质存活率高、稳定可靠的金线莲种质保存方法对金线莲产业的长远发展具有重要的意义。
技术实现要素：
针对目前缺乏有效的金线莲种质资源保存方法的问题，本发明提供一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，用来保存金线莲的野生种质资源以及人工栽培的优质种源，有利于金线莲遗传多样性的延续，也满足科学开发利用金线莲种质资源的需要。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种金线莲种质的试管苗慢生长保存方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
s1、外植体的取材与消毒
选择长势优良、无病虫害的金线莲植株，用流动水将植株洗净，去除根部及叶片，保留茎段作为外植体，在超净工作台中进行消毒处理；
s2、接种与诱导
将步骤s1消毒后的外植体切割成1-2cm的带节茎段，接种于诱导培养基中，在温度22-24℃、相对湿度60-65%、光照强度1000-1400lx、光照时间6-8h/d的条件下诱导丛生芽，培养时间为25-30d；
s3、继代增殖
将步骤s2诱导出的丛生芽切成具有2-4个不定芽的小块，接种在增殖培养基上，每21d继代1次，继代2-3次获得的试管苗作为种质保存材料；培养条件控制为温度22-24℃，相对湿度60-65%，光照强度1500-2000lx，避免直射，光照时间10-12h/d；
s4、试管苗变温盐胁迫诱导
将步骤s3获得的试管苗置于温度25℃、光照强度1500lx、光照14h与温度3℃、黑暗10h交替培养2d，然后用浓度为50mmol/lnacl溶液处理1d，盐胁迫诱导试管苗；
s5、试管苗慢生长保存
将上述处理后的试管苗转接至种质保存培养基上，在培养基上覆盖一层无菌液体石蜡，然后置于温度10-15℃、相对湿度55-60%、光照强度400-600lx、每天光照12h的条件下使试管苗缓慢生长，每12个月继代一次，继代次数最多不超过4次；
s6、试管苗复壮
金线莲种质保存期结束后，将上述步骤中存活的试管苗转接到复壮培养基中使其恢复生长，培养条件控制为温度23-27℃，相对湿度60-65%，光照强度为1400-1800lx，避免直射，每天光照12-14h，培养时间为17-23d；
s7、试管苗生根
当复壮后的试管苗长到4-5cm时，将苗切成单株转接到生根培养基中，在温度23-27℃、光照强度2500-3000lx、每天光照13-15h的条件下诱导生根，培养时间为26-32d，可见试管苗叶色浓绿，根多粗壮；
s8、移栽
将试管苗连同组培瓶转移到炼苗大棚中，打开瓶口适应性炼苗7-10d；然后将试管苗从瓶中小心取出，洗去根部的培养基残留，将根部在质量分数为0.01%的高锰酸钾溶液中浸泡10min，然后移栽入大棚的栽培基质中，大棚的环境要求为温度23-28℃，空气相对湿度80-90%，散射光照射，光照强度2600-3000lx，通风良好。
所述步骤s1中外植体消毒处理的方法为：先用70%异丙醇消毒30s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞+3滴吐温20消毒8min，无菌水冲洗4-6次；最后用500mg/l聚乙烯吡咯烷酮浸泡6min，滤纸吸去多余水分后备用。
所述步骤s2中诱导培养基的配方以ms为基本培养基，附加naa0.2mg/l、tdz0.4mg/l、柠檬汁53ml/l、水解乳蛋白5.8g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤s3中增殖培养基的配方以ms为基本培养基，附加6-ba2.0mg/l、naa0.5mg/l、2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺0.9mg/l、酵母浸粉9g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤s5中覆盖的无菌液体石蜡需高出培养基表面6-8mm。
所述步骤s5中种质保存培养基的配方为：kno3940~1000mg/l，(nh4)2so4818~830mg/l，cacl2·2h2o217~225mg/l，mgso4·7h2o180~190mg/l，kh2po493~99mg/l，mnso4·4h2o31~33mg/l，znso4·7h2o8.5~9.0mg/l，h3bo35.9~6.3mg/l，ki0.7~0.8mg/l，cocl2·6h2o0.024~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.23~0.27mg/l，eddha-fe33~35mg/l，肌醇47~55mg/l，脯氨酸4~6mg/l，色氨酸2~4mg/l，甲硫氨酸2~4mg/l，盐酸硫胺素0.3~0.4mg/l，盐酸吡哆醇0.4~0.5mg/l，维生素b50.3~0.4mg/l，嘧啶醇20~30μmol/l，甲基丁二酸4.8~5.4mg/l，茶多酚6.0~6.4mg/l，乙酰水杨酸0.5~0.7mg/l，5-氮杂胞嘧啶核苷5.5~6.0mg/l，蔗糖35~40g/l，甜菜碱15~20mg/l，槲皮素13~17mg/l，恶霉灵5.2~5.6mg/l，薄荷浸提液22~28ml/l，胡萝卜泥30~36mg/l，植物凝胶7~8g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤s6中复壮培养基的配方为：ms（不含琼脂）+谷胱甘肽11~15mg/l+羧甲基纤维素钠2.5~3.0g/l+复硝酚钠1.2~1.6mg/l+柠檬酸钛0.4~0.8mg/l+n-乙酰-5-甲氧基色胺1.1~1.3μmol/l+油菜素内酯0.07~0.10mg/l+植物凝胶2~4g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤s7中的生根培养基的配方以1/2ms为基本培养基，其中琼脂7.5g/l，附加iba0.5mg/l、微囊藻素20mg/l、陶粒0.3g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤s8中栽培基质的成分按重量比为园土：腐熟锯木屑：沙质土：豆粕粉：蔗渣=7：4：2：1：3。
所述步骤s5的种质保存培养基中，薄荷浸提液的制备方法为：取新鲜薄荷茎、叶捣碎，按质量比为1:4的料水比放入60-70℃热水中保温浸提2h，将汁液用200目纱布过滤除去固体残渣，再在超净工作台中用无菌过滤器过滤制成无菌浸提液。
本发明的有益效果具有以下几点：
1）将试管苗置于适当的逆境进行胁迫诱导，使其体内产生对环境胁迫的响应以增强试管苗的抗逆性，进而提高试管苗长期保存后的存活率。
2）对整个金线莲种质试管苗保存的关键环节进行了改良，通过降低培养温度、减少光照强度、减少氧气含量改变了保存培养的微环境，优化了培养基组分，使金线莲试管苗的生长速率降至最小限度，但不失去活力，从而延长继代间隔时间，减少继代次数，使金线莲的种质保存周期长达3-4年。
3）最长保存周期结束后试管苗总体存活率仍能达到59.5%，经过复壮培养后在生根、移栽方面表现良好，是一种行之有效的金线莲种质资源保存方法。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以更好地理解本发明的技术方案，并不用于限定本发明。
实施例1
2013-2017年，以江苏无锡安镇金线莲种植场引进的福建园叶金线莲作为试验材料，按照本发明进行种质保存试验，详细步骤如下：
s1、外植体的取材与消毒
选择长势优良、无病虫害的金线莲植株，用流动水将植株洗净，去除根部及叶片，保留茎段作为外植体，在超净工作台中先用70%异丙醇消毒30s，无菌水冲洗3-4次，再用0.1%升汞+3滴吐温20消毒8min，无菌水冲洗4-6次；最后用500mg/l聚乙烯吡咯烷酮浸泡6min，滤纸吸去多余水分后备用；
s2、接种与诱导
将步骤s1消毒后的外植体切割成1-2cm的带节茎段，接种于诱导培养基中（诱导培养基的配方以ms为基本培养基，附加naa0.2mg/l、tdz0.4mg/l、柠檬汁53ml/l、水解乳蛋白5.8g/l，ph值为5.8），在温度23℃、相对湿度62%、光照强度1200lx、光照时间7h/d的条件下诱导丛生芽，培养时间为25-30d；
s3、继代增殖
将步骤s2诱导出的丛生芽切成具有2-4个不定芽的小块，接种在增殖培养基上（增殖培养基的配方以ms为基本培养基，附加6-ba2.0mg/l、naa0.5mg/l、2-（3，4-二氯苯氧基）三乙胺0.9mg/l、酵母浸粉9g/l，ph值为5.8），每21d继代1次，继代2次获得的试管苗作为种质保存材料；培养条件控制为温度23℃，相对湿度63%左右，光照强度1800lx，光照时间11h/d；
s4、试管苗变温盐胁迫诱导
将步骤s3获得的试管苗置于温度25℃、光照强度1500lx、光照14h与温度3℃、黑暗10h交替培养2d，然后用浓度为50mmol/lnacl溶液处理1d，增强试管苗的抗逆性；
s5、试管苗慢生长保存
将上述处理后的试管苗转接至种质保存培养基上，在培养基表面覆盖一层高出培养基表面6-8mm的无菌液体石蜡，然后置于温度12℃、相对湿度58%、光照强度500lx、每天光照12h的条件下使试管苗缓慢生长，每12个月继代一次，继代3次后继续培养7个月，统计试管苗的总体存活率；
种质保存培养基的配方为：kno3970mg/l，(nh4)2so4824mg/l，cacl2·2h2o221mg/l，mgso4·7h2o185mg/l，kh2po496mg/l，mnso4·4h2o32mg/l，znso4·7h2o8.7mg/l，h3bo36.1mg/l，ki0.75mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，eddha-fe34mg/l，肌醇51mg/l，脯氨酸5mg/l，色氨酸3mg/l，甲硫氨酸3mg/l，盐酸硫胺素0.35mg/l，盐酸吡哆醇0.45mg/l，维生素b50.35mg/l，嘧啶醇25μmol/l，甲基丁二酸5.1mg/l，茶多酚6.2mg/l，乙酰水杨酸0.6mg/l，5-氮杂胞嘧啶核苷5.8mg/l，蔗糖37.5g/l，甜菜碱17.5mg/l，槲皮素15mg/l，恶霉灵5.4mg/l，薄荷浸提液25ml/l，胡萝卜泥33mg/l，植物凝胶7.5g/l，ph值为5.8；其中薄荷浸提液的制备方法为：取新鲜薄荷茎、叶捣碎，按质量比为1:4的料水比放入60-70℃热水中保温浸提2h，将汁液用200目纱布过滤除去固体残渣，再在超净工作台中用无菌过滤器过滤制成无菌浸提液；
s6、试管苗复壮
金线莲种质保了3年7个月后，将上述步骤中存活的试管苗转接到复壮培养基中（该培养基的配方为：ms（不含琼脂）+谷胱甘肽13mg/l+羧甲基纤维素钠2.75g/l+复硝酚钠1.4mg/l+柠檬酸钛0.6mg/l+n-乙酰-5-甲氧基色胺1.2μmol/l+油菜素内酯0.08mg/l+植物凝胶3g/l，ph值为5.8）使其恢复生长，培养条件控制为温度25℃，相对湿度63%，光照强度为1600lx，避免直射，每天光照13h，培养时间为17-23d，观察试管苗长势；
s7、试管苗生根
当复壮后的试管苗长到4-5cm时，将苗切成单株转接到生根培养基中（生根培养基的配方以1/2ms为基本培养基，其中琼脂3.5g/l，附加iba0.5mg/l、微囊藻素20mg/l、陶粒0.3g/l，ph值为5.6~6.0），在温度25℃、光照强度2800lx、每天光照14h的条件下诱导生根，培养时间为26-32d，统计试管苗生根率，平均生根数；
s8、移栽
将试管苗连同组培瓶转移到炼苗大棚中，打开瓶口适应性炼苗7-10d；然后将试管苗从瓶中小心取出，洗去根部的培养基残留，将根部在质量分数为0.01%的高锰酸钾溶液中浸泡10min，然后移栽入大棚的栽培基质中，栽培基质的成分按重量比为园土：腐熟锯木屑：沙质土：豆粕粉：蔗渣=7：4：2：1：3，大棚的环境要求为温度23-28℃，空气相对湿度80-90%，散射光照射，光照强度2600-3000lx，通风良好；移栽30d后统计移栽成活率。
实施例2
为了证明胁迫诱导方法对种质保存效果的影响，本实施例取消了实施例1中步骤s3，其余步骤与实施例1一致，不再赘述。
实施例3
为了证明本发明的种质保存培养基对种质保存效果的影响，本实施例将实施例1步骤s5中种质保存培养基替换为ms培养基，其余步骤与实施例1一致，不再赘述。
实施例4
为了证明本发明的种质复壮培养基对种质保存效果的影响，本实施例将实施例1步骤s6中复壮培养基替换为ms培养基，其余步骤与实施例1一致，不再赘述。
结果统计
1、种质保存3年7个月后，将实施例1-4中各项统计数据汇总如下表1。
比较实施例1与实施例2的数据，发现实施例1的试管苗存活率明显高于实施例2，说明本发明的变温盐胁迫诱导行之有效，能够通过增强试管苗抗逆性来提高长期保存的存活率；比较实施例1与实施例3和4的数据，发现实施例1的各项数据指标都优于其他实施例，说明本发明的种质保存培养基和种质复壮培养基都是经过深入研究的最优配方，对金线莲的种质保存和恢复生长都具有最好效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。