蔗果四糖在促进水稻根系生长和提高根系耐低温胁迫能力中的应用的制作方法

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及蔗果四糖在促进水稻根系生长和提高根系耐低温胁迫能力中的应用。

背景技术：

植物免疫诱抗剂又称植物疫苗，能够激活植物体内分子免疫系统，使植物自身产生抗菌物质，提高植物抗病性，同时还能激发植物体内的一系列代谢调控系统，具有促进植物生长和增加作物产量的作用。植物天然免疫具有预防性、系统性、稳定性、相对性、安全性等一系列优点，可以解决化学防治存在的病原菌抗药性、环境污染和对人畜副作用的问题，实现农产品无害化生产和农业可持续发展。

目前，诱抗剂可分为非生物来源和生物来源两大类。非生物来源的诱抗剂包括无机盐、有机酸、寡糖类、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。生物来源的诱抗剂除源自植物的寡聚半乳糖和源自细菌的过敏素(harpin)外，还包括病毒衣壳蛋白、糖蛋白类等诱抗剂。

有些生物源激发子是无毒基因的产物，是专化性的，但大部分激发子是非专化性的。病原微生物作为激发子可以是活体菌、菌体培养滤液、菌体匀浆或菌体细胞提取液等，主要是非致病性或弱致病性病菌。

研究发现可可丛枝病原菌crinipellisperniciosa菌丝体的水溶液可激活番茄对疮痂病的抗性，诱导体内过氧化物酶、多酚氧化酶、几丁质酶的积累和木质素的沉积。黄青霉penicilliumchrysogenum的提取物可以作为诱导因子，诱导拟南芥对霜霉病、灰霉病、黑斑病和细菌性斑点病的抗性。木霉菌可直接与植物相互作用，能够诱导植物产生对病原菌的抗性。大蒜、洋葱、花椒、大黄等植物源提取物作为激发子可以诱导马铃薯抗晚疫病。前胡、白芷的水提取液可诱导水稻对稻瘟病的抗性及小麦对赤霉病的抗性。青蒿、独活可诱导西瓜抗花叶病。

果寡糖又名低聚果糖，是在蔗糖分子基础上以糖苷键的形式结合数个d-果糖所形成的一类低聚糖的总称，具有低热、稳定、安全无毒的良理化性能，大部分不能被动物本身的消化酶所消化，但到达肠道后可作为有益微生物的底物，而不能被病原微生物利用，从而促进有益微生物的繁殖和抑制有害微生物。果寡糖还能促进人体内b族维生素合成，提高机体新陈代谢水平，增强免疫力和抗病力，同时促进钙、镁、铁等矿物质吸收。

天然植物中存在的果寡糖主要是由植物中的果糖转移酶通过催化反应生成，其中富含果寡糖的植物主要有菊薯、菊芋、冬小麦和洋葱等。其中，菊薯粗糖经水浸提法方法检测得知，菊薯粗糖主要是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖组成，其中果寡糖占其干物质的45％-65％。

目前，研究者们对于蔗果四糖的研究较少，其有何功能也尚未可知，因此，有必要对蔗果四糖的功能做进一步地深入探究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供蔗果四糖在促进水稻根系生长以及提高水稻根系耐低温胁迫能力的新用途，为新型免疫诱抗剂的生产奠定理论基础。

具体内容如下：

本发明提供了蔗果四糖在促进水稻根系生长中的应用。

进一步地，所述蔗果四糖促进水稻主根的生长和根系的活力。

本发明通过浸种和种子萌发及幼苗生长试验证明，蔗果四糖能够在水稻根系(种子萌发时)有效促进主根的生长，以及提高主根的根系活力。

本发明还提供了蔗果四糖在提高水稻根系耐低温胁迫能力中的应用。

本发明通过低温处理试验证明，蔗果四糖能够提高水稻根系的耐低温胁迫能力。

进一步地，所述低温为1～10℃。

进一步地，所述蔗果四糖通过降低水稻主根褐化率来提高水稻耐低温胁迫能力。

进一步地，所述蔗果四糖通过诱导水稻幼苗根系中免疫相关蛋白pr10的表达来提高水稻的耐低温胁迫能力。

此外，试验发现，所述蔗果四糖是通过水杨酸、茉莉酸和脱落酸途径诱导免疫相关蛋白pr10的表达。

本发明还提供了一种植物免疫诱抗剂，其有效成分为蔗果四糖。该植物免疫诱抗剂既可以只包含蔗果四糖这一种有效成分；也可以添加助剂如表面活性剂吐温80。

进一步地，植物免疫诱抗剂中，蔗果四糖的浓度为50～75ppm。

本发明还提供了一种水稻幼苗的培养方法，该方法包括：将水稻种子放入含有蔗果四糖的水溶液中进行浸渍，取出后，清洗干净，再进行种子催芽，得到水稻幼苗。

其中，所述蔗果四糖的浓度为50～75ppm；所述浸渍的时间为20～30h，温度为25～30℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过主根长、主根褐化率和根系活力等指标有效证明了蔗果四糖在促进水稻根系生长以及提高水稻根系耐低温胁迫能力的新用途，为新型免疫诱抗剂的生产奠定理论基础。

附图说明

图1为不同处理下水稻主根褐化表型的比较情况；

其中，a为4℃处理正常生长1d后清水浸种；b为4℃处理正常生长1d后75ppm浓度的蔗果四糖浸种；c为4℃处理正常生长3d后清水浸种；4℃处理正常生长3d后75ppm浓度的蔗果四糖浸种。

图2为不同处理下水稻主根褐化率的比较。

图3为不同处理下水稻根系活力的比较。

图4为蔗果四糖浸种处理对免疫相关蛋白pr10表达的影响；

其中，ck：对照；lt：低温处理“+”：蔗果四糖处理；“-”：清水处理；hsp：热激蛋白作为调量对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

一、试验材料

杂交水稻品种“中浙优一号”，由浙江勿忘农种业有限公司提供。

蔗果四糖：为蔗果四糖标准品，购于西宝生物有限公司(纯度99％)。

二、不同浓度的蔗果四糖处理

具体方法如下：

1.配制2％琼脂溶液，放在电磁炉上煮沸10分钟至无明显固体颗粒；

2.将之前制备好的蔗果四糖固体配制成10000ppm(mg/l)的糖溶液；

3.准备12瓶水稻培养瓶，分别为对照、50ppm、75ppm、100ppm糖浓度，其中每个三个重复，每瓶倒入50ml琼脂溶液，待温度降低到不烫手时，加入10000ppm蔗果四糖溶液，配制成不同浓度含有糖溶液的水稻琼脂培养基；

4.称取10g中浙优一号水稻种子，在水稻培养盒中倒入200ml超纯水，放入30℃水稻培养箱浸种一天；

5.倒掉上层水以及上浮的不合格种子，清洗种子两遍，将纱布润湿，铺在种子表面，放入30℃培养箱中催芽一天；

6.挑选已经露白的水稻种子，用镊子将种子插入琼脂培养基中，每个培养瓶插入15粒种子，注意将露白一面朝上，注意不要将已经长出的芽头弄断，不要插入太深，埋入琼脂1/2即可；

7.用薄膜包住瓶口以防止水分蒸发致使琼脂干瘪，放入培养室中培养，培养条件为15℃，湿度70％，光照时间18小时，培养10天测量指标，当水稻长到快顶到瓶口时，掀开薄膜，向每瓶中加入等量的纯水。

表1蔗果四糖处理对水稻根系生长的影响

结果：从表1中可以看出，50ppm和75ppm蔗果四糖处理的水稻主根长均极显著高于对照，而100ppm蔗果四糖处理的水稻主根长与对照相比无显著差异。这说明：在15℃条件下，50ppm和75ppm蔗果四糖显著促进了水稻主根的生长。

三、水稻种子的冷处理

具体方法如下：

(1)称取6份中浙优一号水稻种子，每份10g，每份分别加入至100ml清水或100ml75mg/l蔗果四糖溶液中浸种，重复2次。

(2)30℃浸种24h后，弃去溶液，然后用纯水清洗三遍，以洗去多余的糖溶液。

(3)将水稻种子置于用水润湿滤纸的发芽盒中，上面盖一层用纯水浸润的滤纸，然后放入30℃培养箱中催芽45h。

(4)挑选根长约1cm和芽长0.5cm左右长势正常的水稻幼苗平铺在湿润滤纸的发芽盒中，每行可以摆放8粒幼苗，共6排一共为48粒。

按照上述方法摆放6盒清水浸种幼苗，6盒蔗果四糖浸种幼苗。其中每个实验组三盒幼苗放入4℃冰箱处理48h，余下每个实验组的三盒幼苗放在25℃培养。

(5)48h后拿出冷处理(4℃)幼苗与正常培养(25℃)幼苗放在27℃培养室中培养，光照每天18h。

(6)实时观察幼苗表型，统计水稻幼苗根部褐化数目，当出现较为明显表型时，拍照保存。

结果：通过用75ppm蔗果四糖浸种的水稻经过低温4℃处理后恢复5天的表型观察(图1)，结果发现清水浸种的水稻根部呈现出不同程度的褐化，统计水稻主根褐化率，蔗果四糖浸种水稻根部褐化率极显著低于清水浸种水稻(图2)。

四、水稻根系活力测定方式

具体方法如下：

1.将表型明显的处理组和对照组的水稻幼苗(一般在冷处理完恢复3天后)主根剪下，每份称取0.5g，每个实验组三个重复，再剪成约0.5cm的小段。将剪碎的水稻根放入10ml离心管中，同时加入5ml新鲜配制的0.4％ttc溶液和5ml磷酸缓冲液等量混合成10ml保证所有根都浸没在混合溶液中。在37℃的恒温培养箱中暗处理2小时，以保证所有根充分染色(显红色)。

2.与此同时，制作ttc标准曲线，取0.4％ttc溶液0.4ml再加入19.6ml乙酸乙酯和适量的保险粉，它们所反应生成的红色溶液为ttf溶液作为制作标准曲线的母液。分别配制20、40、80、120、160、200微克的ttf溶液，其中配置20微克ttf反应液所需的母液与甲醇的体积分别0.5ml和19.5ml，用紫外分光光度计485nm波长测定6个梯度的od值，绘制标准曲线。

3.暗处理反应完成后，向每个管子中加入2ml的1mol/l的硫酸以中止反应。将根取出倒入包有滤纸的漏斗中，将溶液尽量滤干。向50ml离心管中加入10ml甲醇，将根加入甲醇中，37℃恒温培养箱中避光过夜脱色至根部变白为止。

4.用分光光度计测定485nm下od值，利用标准曲线获得相应od值下ttf的质量，根据公式a＝cm/nt其中a为根系活力，c为标准曲线上获得的ttf值，m为测定吸光值时的稀释倍数，n为质量，t为用ttc溶液染液的反应时间。作图并分析数据。

结果：从图3可以看出，蔗果四糖浸种处理水稻幼苗根系活力显著高于清水浸种，但与正常生长水稻根系活力相比较弱，而在正常生长情况下，蔗果四糖浸种幼苗与清水浸种幼苗根系活力相近，说明蔗果四糖在水稻冷处理时对水稻根部具有独特的保护作用。

五、蛋白质组学分析方式

1.水稻材料培养与冷处理

1.1称取8份中浙优一号水稻种子，每份10g，每份分别加入至100ml清水、100ml75mg/l蔗果四糖溶液中浸种，重复4次。

1.230℃浸种24h后，弃去溶液，然后用纯水清洗三遍，以洗去多余的糖溶液。

1.3将水稻种子置于用水润湿滤纸的发芽盒中，上面盖一层用纯水浸润的滤纸，然后放入30℃培养箱中催芽45h。

1.4挑选根长约1cm和芽长0.5cm左右长势正常的水稻幼苗平铺在湿润滤纸的发芽盒中，每行可以摆放8粒幼苗，共6排一共为48粒。按照上述方法摆放18盒清水浸种幼苗，18盒蔗果四糖浸种幼苗。

其中，准备三盒对照和三盒蔗果四糖浸种水稻幼苗4℃处理24小时，六盒对照和六盒处理4℃处理48小时，取出三盒对照和三盒处理4℃处理48小时，另外再准备三盒对照和三盒处理4℃处理48小时后恢复正常培养5天。

1.524小时后剪下24小时冷处理水稻幼苗的根以及剪下正常培养的其中三盒清水浸种和三盒蔗果四糖浸种水稻幼苗的根，用液氮冻存，48小时后取下剩下水稻幼苗的根用液氮冻存，48小时后再恢复正常培养5天，取下剩下水稻幼苗的根用液氮冻存，作为蛋白质组学实验材料。

2.水稻根蛋白质提取、酶解及质谱分析

2.1配制蛋白提取液ii：500ml丙酮+350μlβ-巯基乙醇和蛋白提取液i：40g三氯乙酸(tca)溶于400ml的蛋白提取液ii。

2.2用液氮将水稻根研成粉，装入2ml离心管中(将勺匙放入液氮中预冷)。加入1.5ml蛋白提取液i(-20℃，1h)期间晃匀5～6次，4℃13000rpm离心20min。

2.3弃上清，加入1.5ml蛋白提取液ii(-20℃，1h)期间晃匀5～6次，4℃13000rpm离心20min。重复步骤3的操作2次。取沉淀，真空抽干得到粗蛋白干粉(抽干时间约为半小时左右)。

2.4配制裂解液utc：8m尿素，100mmtris-hcl(ph8.5)，1mmpmsf(pmsf储液浓度100mm，乙醇配制)。用裂解液溶解粗蛋白干粉(5～10μl/mg)，室温放置1h(旋涡5～6次)。

2.54℃12000rpm离心20min取上清得蛋白样品进行浓度测定。用bradford法测定蛋白浓度，一般将蛋白浓度控制在1mg/ml左右。

2.6根据已经测定的蛋白浓度，计算酶解150微克蛋白所需要的蛋白的量，反应总体积设定为200微升，不足的液体用碳酸氢铵补足。

2.7加入11μl100mm的dtt使其终浓度为10mm，适度旋涡，放于37℃的金属浴上反应1h。

2.8加入12μl500mm的iaa使其终浓度为50mm左右，避光室温反应30min。

2.9将上述反应液转移至超滤管中，4℃12000rpm离心15min.。弃收集管中废液，再向超滤管中加入150μl100mmnh4hco34℃12000rpm离心15min.。重复步骤4的操作1次。

2.10更换新的收集管，超滤管中加入100mmnh4hco3至总体积为100μl，按照蛋白质量：trypsin＝25:1的比例加入trypsin(1μg/μl)，于37℃金属浴上过夜(12h至16h)。酶解完成4℃12000rpm离心15min，再向超滤管中加入100μl100mmnh4hco3重复离心一次即得肽段溶液。在肽段溶液中加入5％tfa至tfa终浓度为0.1-1％，使肽段酸化。

2.11将c18tip紧密固定在100μl移液器上，吸取100μl50％acn后打出，重复一次以润湿c18填料。2.12吸取吹打0.1％tfa2次以平衡c18tip。吸取吹打肽段样品50次以达到最佳吸附效果。

2.12吸取吹打0.1％tfa/5％acn10次以清洗肽段样品。依次缓慢吸取50μl含0.1％tfa的50％、60％、70％、80％已腈以洗脱肽段，并将洗脱液收集到新的1.5mlep管中。

2.13得到终体积200μl的样本，真空旋转抽干。加入80μl0.1％fa适当涡旋溶解，转移至样品瓶中上机检测。

3.蛋白质组学数据生物信息学分析方法

3.1采集质谱所获得的数据，导入maxquant软件中分析，查看结果，获得可信度较高的蛋白总数。

3.2将maxquant软件分析的结果文件“proteingroup”导入perseus软件，通过相关系数分析三个重复之间的重复性如何。

3.3制作火山图根据p值小于等于0.5(即-logp大于等于1.3)和difference大于等于0.585(即foldchange大于等于1.5)来筛选出显著上调的蛋白，同样的根据difference小于等于-0.585来筛选出显著下调的蛋白。

3.4按照以下表格(表2和表3)中蔗果四糖处理(简称糖处理)和对照进行分析，以下，以下分析组用字母编号代替。

表2不同处理编号

表3不同处理相互比较

3.5分析上调和下调差异蛋白，韦恩图分析的共同差异上调和下调蛋白，并做go和kegg分析。

结果：

表4ck1vst1上调差异蛋白

表5ck1vst1下调差异蛋白

表6lck1vslt1上调差异蛋白

表7lck1vslt1下调差异蛋白

表8ck2vst2上调差异蛋白

表9ck2vst2下调差异蛋白

表10lck2vslt2上调差异蛋白

表11lck2vslt2下调差异蛋白

表12ck7vst7显著上调蛋白

表13ck7vst7显著下调蛋白

表14rck7vsrt7显著上调蛋白

表15rck7vsrt7显著下调蛋白

表16蔗果四糖处理诱导生物与非生物逆境相关蛋白质的表达

将数据导入maxquant软件分析后获得初步蛋白质组学数据，随后按照表2的比较组进行相互比较，根据p值大于等于0.05为显著，即-log10大于等于1.3，同时筛选显著上调的差异蛋白，以difference大于等于0.585为标准即foldchange大于等于1.5，同理筛选出显著下调的蛋白，以difference小于等于-0.585为标准即foldchange小于等于-1.5。筛选获得的显著上调和下调蛋白数，同时，分别列出了ck1vst1(表4和附表5)、lck1vslt1(附表6和附表7)、ck2vst2(附表8和附表9)和lck2vslt2(附表10和附表11)的显著上调和下调蛋白的差异倍数。

与对照相比，正常条件培养24h下，蔗果四糖处理的差异蛋白数64个，其中上调蛋白41个和下调蛋白23个，而在低温条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数36个，其中上调蛋白23个和下调蛋白13个。正常条件培养48h下，蔗果四糖处理的差异蛋白数95个，其中上调蛋白51个和下调蛋白44个，而在低温条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数97个，其中上调蛋白53个和下调蛋白44个。正常条件培养7d下，蔗果四糖处理的差异蛋白数81个，其中上调蛋白31个和下调蛋白50个，而在低温2d后正常培养5d条件下，蔗果四糖处理的差异蛋白数124个，其中上调蛋白49个和下调蛋白75个。

另外，从上述差异蛋白中，具体列出了23个与生物逆境和非生物逆境相关蛋白(附表16)，它们主要参与激素茉莉酸、水杨酸、脱落酸等信号途径。

为了验证蛋白表达的真实性，选取3个免疫相关蛋白pr10即rsospr10、pr10a和ospr10c，利用免疫印迹法(westernblot)检测24h(正常/低温处理)和48h(正常/低温处理)的3个蛋白表达情况(图4)，结果发现，在正常培养24h条件下仅rsospr10受蔗果四糖诱导表达，而在正常培养48h条件下，rsospr10、pr10a和ospr10c均受蔗果四糖诱导表达。在低温处理下，3个蛋白均受低温诱导表达。

六、水杨酸、茉莉酸和脱落酸含量的测定

实验方法如下：

一、标准品配制

用分析天平称取适量的植物激素标准品，用初始流动相(5％乙腈+0.1％甲酸+94.9％水溶液)溶解，配制高浓度的水杨酸、(+/-)-脱落酸和(+/-)-茉莉酸的标准品储备液。待得到高浓度植物激素标准储备液后，用初始流动相(5％乙腈+0.1％甲酸+94.9％水溶液)依次进行梯度稀释，上机检测，并选择合适浓度值绘制“浓度-峰面积”标准曲线。

二、样品前处理

激素提取：

1.用万分之一天平准确称取0.2g样品于5ml离心管中，加入钢珠，加入1.5ml提取液(甲醇：水：甲酸＝7.9：2：0.1，含少量抗氧化剂)，破碎3min以上。

2.冰上超声30min，低速涡旋、离心混匀，4℃浸提12h。

3.离心(4℃，12000rpm，20min)后取上清。

4.滤渣中加入1.0ml提取液，冰上超声30min，混匀离心，4℃浸提1h.

5.离心(4℃，12000rpm，20min)后取上清，合并浸提液。

固相萃取：

1.将小柱固定到固相萃取仪上。

2.小柱活化：依次用4ml甲醇、2ml0.1m氨水溶液活化小柱，再将样品流过max小柱。

3.淋洗：依次用2ml0.1m氨水溶液，2ml0.1m氨水60％甲醇溶液淋洗。

4.洗脱：用2.5ml1.25m甲酸70％甲醇溶液将样品完全洗脱至新的离心管中。

浓缩复溶：

1.将收集到的洗脱液干燥浓缩成粉末。

2.每个样品用0.12ml起始流动相(5％乙腈+0.1％甲酸+94.9％水溶液)复溶，涡旋震荡混匀。再经0.2μm的尼龙膜过滤后即可上机检测。

2.3.上机检测

本实验采用uplc-esi-ms/ms分析方法，对各种激素进行定性定量检测。

结果如下：

表17蔗果四糖处理对低温条件下水稻根系水杨酸、茉莉酸和脱落酸含量的影响

实验结果发现，与清水对照相比，蔗果四糖处理明显提高低温条件下水稻根系中水杨酸、茉莉酸和脱落酸的含量，说明蔗果四糖进一步激活了低温条件下水杨酸、茉莉酸和脱落酸信号途径，从而提高水稻根系抗低温能力。