一种高效获取双孢蘑菇担孢子同核体的方法与流程

本发明涉及蘑菇栽培育种和改良技术领域，具体涉及高效获取双孢蘑菇担孢子同核体的方法。

背景技术

双孢蘑菇agaricusbisporus(lange)sing，又称双孢菇、洋菇(台湾)。它在分类学上隶属于真菌门(eumycota)、担子菌纲(basidiomycetes)、伞菌目(agaricales)、蘑菇科(黑伞科)(agaricaceae)、蘑菇属(黑伞属)(agaricus)。

双孢蘑菇（agaricusbisporus）是世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，具有重要的经济价值。我国自20世纪30年代引入栽培以来，已在全国各地推广种植，其中种植面积较多的有福建、山东、河南和浙江等省。双孢蘑菇是具有不同交配类型生活史的不同自然居群的物种,它分别具有次级同宗配合的交配类型-生活史,异宗配合的交配类型-生活史,以及同时具有次级同宗配合和异宗配合的双重生活史。这3种生活史主要依据其担子产生担孢子的数量和担孢子的核型是同核体还是异核体来划分。

现在人们所栽培的全部品种,以及绝大部分野生居群都有属于双孢蘑菇原变种生活史，这一变种,它包括99%的法国野生居群,加拿大alberta居群,加利福尼亚海滨居群,英国,以色列,荷兰等居群。这一变种的特征是子实体的每个担子几乎都只产生2个担孢子,且担子核减数分裂后形成的四个子核,不是随机地分别成对进入两个担子,而是非姊妹核配成一对进入一个担孢子,这样产生的担孢子都是异核体,孢子萌发形成异核体菌落,所以这个变种主要行次级同宗配合的交配类型生活史，elliott对双孢蘑菇担子种类的统计结果为双孢担子产生概率为95%，三孢担子产生概率为4.5%，四孢担子产生概率为0.5%。1972年raper,elliott等人对双孢蘑菇生活史进行了详细的研究，并利用遗传标记作分析的工具，揭示了蘑菇杂交育种存在两个障碍:一是它具有独特的遗传特性，使担子上的两个孢子大多具有异核而自身可育;二是它的同核体与异核体间没有形态上的差异，即异核体也无锁状联合现象并且由于世界双孢蘑菇野生资源分缺乏，给双孢蘑菇菌种改良和选育工作带来了相当大的困难。

目前双孢蘑菇同核体获得方法有原生质体法、单孢分离法。单孢子分离法通过观察分离的担子生长速度和形态挑选出单孢同核体，由于同核体数量稀少，据统计同核孢子约占孢子总数的5.6%，因此单孢分离耗时费力。现有技术缺乏一种能够高效获取效获取双孢蘑菇担孢子同核体的方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明根据双孢蘑菇不同发育时期的同核率不同，通过对发育时期的选择，来获取双孢蘑菇担孢子，可有效提高同核体孢子获取效率。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种高效获取双孢蘑菇担孢子同核体的方法，所述方法包括如下：

步骤（1）：蘑菇种植

双孢蘑菇挑选种类并在蘑菇种植设施中种植培育试样。上述种植设施为常规蘑菇种植设施。

步骤（2）：取样

在双胞蘑菇采摘阶段，按时间先后划分为内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期五个发育阶段进行蘑菇取样。

步骤（3）：分析

挑取不同发育阶段蘑菇的菌褶，以蘑菇内菌幕的形态将发育阶段划分为内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，统计不同发育阶段菌褶上发育出孢子梗的担子数量及不同担子的比例。

步骤（4）：确定最佳获取时期

根据步骤（3）结果确定所述的内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期五个发育阶段中至少一个发育阶段为最佳获取时期。

步骤（5）：大批量采取担孢子同核体

根据步骤（4）确定的最佳获取时期，对剩余蘑菇进行大批量采取担孢子同核体。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：所述双孢蘑菇品种为w192。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：确定最佳获取时期为内菌幕初现期。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：内菌幕初现期的双孢蘑菇子双孢担子产生概率为75%，三孢担子产生概率为25%，四孢担子产生概率为0%。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：所述分析过程步骤如下：

a取样，采摘不同发育阶段的双孢蘑菇子实体，包括内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期，牙签挑取不同发育阶段菌褶，避免划伤需观察的菌褶部位；

b预固定，2.5%的戊二醛溶液中4℃过夜或2h以上；

c漂洗，倒掉固定液，用0.1m、ph7的磷酸缓冲液漂洗三次，每次十五分钟；

d再固定，1%饿酸溶液固定1-2h，置于通风橱内；

e漂洗，重复步骤c；

f脱水，所述梯度脱水为梯度酒精脱水；

g过度，使用v/v为1:1的乙醇和乙酸乙戊酯混合液处理30分钟，纯乙酸乙戊酯处理1h；

h:临界点干燥；

i：利用离子溅射仪在样品表面喷上一层导电金。

观察：将处理过的菌褶平放到粘在有导电性和粘性的炭膜的扫描电子显微镜样品台上；统计不同发育阶段菌褶上发育出孢子梗的担子数量及不同担子的比例。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：所述步骤（5）中至少重复循环实施步骤（2）、步骤（3）、步骤（4）至少一次。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：所述酒精脱水步骤为依次使用浓度为50%、70%、80%、90%、95%的酒精浸泡15min；100%浸泡20min。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：蘑菇内菌幕初现期的内菌幕形状为圆环状并环绕包裹菌柄。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：所述蘑菇内菌幕初现期的内菌幕最下端的高度与菌褶的高度差大于0.2-0.5mm，所述内菌幕形成的圆环宽度为所述菌柄直径的0.2-0.5倍。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：实施所述方法的系统包括临界点干燥仪（emitechk850）、离子溅射仪（hitachie1045）、扫描电子显微镜（hitachitm3000）。

作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：上述种植设施由多个种植组件拼接而成，上述种植组件包括底板，上述底板中央纵向设置有蘑菇条播箱，上述条播箱内种植有蘑菇。用于将蘑菇间隔成行种植，方便检测和收割。

上述蘑菇的上空悬设有丝杠，丝杠两端设有与底板竖直相连的支撑座；上述丝杠上设有可沿丝杠运动的滚珠丝杠移动台，上述移动台的一侧设有蘑菇切割装置，上述移动台的另一侧设有蘑菇检测装置，上述蘑菇检测装置的后端还设有蘑菇收集装置，上述蘑菇检测装置的前端设有控制装置；移动台带动蘑菇检测装置依次检测蘑菇，蘑菇符合收割要求的时候，控制器控制蘑菇切割装置割断蘑菇，同时将蘑菇推到一侧设置的蘑菇收集装置中。

控制装置，其包括控制器；上述控制器连接滚珠丝杠移动台的移动电机；

蘑菇切割装置，其包括盘刀，上述盘刀通过转轴与从动轮相连，上述从动轮通过皮带与主动轮相连，上述主动轮与盘刀电机相连，上述盘刀电机的前端设有推板，上述盘刀电机的后端与电动水平推拉杆相连，上述盘刀电机的底部设有滑板，上述滑板底部设有滚轮或滚珠，上述滚轮设于滑槽中；上述滑槽设于安装板上。上述盘刀电机和电动水平推拉杆通过电路与控制器相连。用于割断蘑菇。

上述蘑菇检测装置包括至少一个激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪，上述激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪上设有用于发射激光或者射线到蘑菇上并用于检测内菌幕初现期的内菌幕最下端的高度与菌褶的高度差的传感器。上述激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪通过电路与控制器相连。用于检测内菌幕初现期的内菌幕最下端的高度与菌褶的高度差，高度差大于0.2-0.5mm则控制器发信号，移动台移动一个位置，将蘑菇切割装置对准满足要求的蘑菇。

上述蘑菇收集装置包括一个敞口框或箱。用于收集蘑菇。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1）利用蘑菇处于内菌幕初现期，来获取双孢蘑菇担孢子同核体，能够大大提高获取的效率；

2）本发明装置中能够自动化判断种植的蘑菇哪些处于内菌幕初现期，可以大大提高工人效率，降低工人的劳动强度。

附图说明

图1双孢蘑菇发育过程中6个不同发育时期。

图2不同发育时期单位面积中已发育担子数量。

图3不同发育时期2、3、4孢担子比例。

图4本发明种植设施立体图。

图5本发明种植设施的第二种立体图。

图6为图5中位置a的局部放大图。

图7为本发明测量原理示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

一种高效获取双孢蘑菇担孢子同核体的方法，所述方法包括如下：

步骤（1）：蘑菇种植

双孢蘑菇挑选种类并在蘑菇种植设施中种植培育试样。本实施例中蘑菇种植设施采用普通的人工大棚种植，手工收获蘑菇，肉眼观测内菌幕的出现。

步骤（2）：取样

在双胞蘑菇采摘阶段，按时间先后划分为内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期五个发育阶段进行蘑菇取样。

步骤（3）：分析

挑取不同发育阶段蘑菇的菌褶，以蘑菇内菌幕的形态将发育阶段划分为内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，统计不同发育阶段菌褶上发育出孢子梗的担子数量及不同担子的比例。

步骤（4）：确定最佳获取时期

根据步骤（3）结果确定所述的内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期五个发育阶段中至少一个发育阶段为最佳获取时期。

步骤（5）：大批量采取担孢子同核体

根据步骤（4）确定的最佳获取时期，对剩余蘑菇进行大批量采取担孢子同核体。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：所述双孢蘑菇品种为w192。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：确定最佳获取时期为内菌幕初现期。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：内菌幕初现期的双孢蘑菇子双孢担子产生概率为75%，三孢担子产生概率为25%，四孢担子产生概率为0%。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：所述分析过程步骤如下：

a取样，采摘不同发育阶段的双孢蘑菇子实体，包括内菌幕未现期，内菌幕初现期，内菌幕内凹期，内菌幕平坦期，内菌幕裂缝期，牙签挑取不同发育阶段菌褶，避免划伤需观察的菌褶部位；

b预固定，2.5%的戊二醛溶液中4℃过夜或2h以上；

c漂洗，倒掉固定液，用0.1m、ph7的磷酸缓冲液漂洗三次，每次十五分钟；

d再固定，1%饿酸溶液固定1-2h，置于通风橱内；

e漂洗，重复步骤c；

f脱水，所述梯度脱水为梯度酒精脱水；

g过度，使用v/v为1:1的乙醇和乙酸乙戊酯混合液处理30分钟，纯乙酸乙戊酯处理1h；

h:临界点干燥；

i：利用离子溅射仪在样品表面喷上一层导电金。

观察：将处理过的菌褶平放到粘在有导电性和粘性的炭膜的扫描电子显微镜样品台上；统计不同发育阶段菌褶上发育出孢子梗的担子数量及不同担子的比例。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：所述步骤（5）中至少重复循环实施步骤（2）、步骤（3）、步骤（4）至少一次。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：所述酒精脱水步骤为依次使用浓度为50%、70%、80%、90%、95%的酒精浸泡15min；100%浸泡20min。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：蘑菇内菌幕初现期的内菌幕形状为圆环状并环绕包裹菌柄。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：所述蘑菇内菌幕初现期的内菌幕最下端的高度与菌褶的高度差大于0.2-0.5mm，所述内菌幕形成的圆环宽度为所述菌柄直径的0.2-0.5倍。

在本实施例中，本发明提供的的方法进一步设置为：实施所述方法的系统包括临界点干燥仪emitechk850、离子溅射仪hitachie1045、扫描电子显微镜hitachitm3000。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，种植设施不同，使用本实施例中的种植设施，能够大大提高本方法的工作效率，更加高效的获取双孢蘑菇17担孢子同核体，作为优选，本发明提供的的方法进一步设置为：上述种植设施由多个种植组件拼接而成，上述种植组件包括底板1，上述底板1中央纵向设置有蘑菇条播箱2，上述条播箱2内种植有蘑菇17。用于将蘑菇17间隔成行种植，方便检测和收割。

上述蘑菇17的上空悬设有丝杠9，丝杠9两端设有与底板1竖直相连的支撑座；上述丝杠9上设有可沿丝杠9运动的滚珠丝杠移动台11，滚珠丝杠移动台为现有技术，上述移动台的一侧设有蘑菇切割装置，上述移动台的另一侧设有蘑菇检测装置，上述蘑菇检测装置的后端还设有蘑菇收集装置，上述蘑菇检测装置的前端设有控制装置；移动台带动蘑菇检测装置依次检测蘑菇17，蘑菇17符合收割要求的时候，控制器18控制蘑菇切割装置割断蘑菇17，同时将蘑菇17推到一侧设置的蘑菇收集装置中。

控制装置，其包括控制器18；上述控制器18连接滚珠丝杠移动台11的移动电机；

蘑菇切割装置，其包括盘刀5，上述盘刀5通过转轴6与从动轮相连，上述从动轮71通过皮带7与主动轮15相连，上述主动轮15与盘刀电机13相连，上述盘刀电机的前端设有推板12，上述盘刀电机13的后端与电动水平推拉杆14相连，上述盘刀电机的底部设有滑板131，上述滑板131底部设有滚轮132或滚珠，上述滚轮132设于滑槽16中；上述滑槽16设于安装板161上。上述盘刀电机13和电动水平推拉杆14通过电路与控制器18相连。用于割断蘑菇17。

上述蘑菇检测装置包括至少一个激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪8，上述激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪上设有用于发射多束激光或者射线到蘑菇17上并用于检测内菌幕初现期的内菌幕171最下端的高度与菌褶172的高度差的传感器10。上述激光三维扫描仪或者非接触式高度检测仪通过电路与控制器18相连。用于检测内菌幕初现期的内菌幕171最下端的高度与菌褶172的高度差h，当所述内菌幕形成的圆环宽度l为所述菌柄173直径的0.2-0.5倍,高度差h大于0.2-0.5mm则控制器18发信号，移动台移动一个位置，将蘑菇切割装置对准满足要求的蘑菇17。

上述蘑菇收集装置包括一个敞口框4或箱。用于手机蘑菇17。

上述在种植设施中育种种植蘑菇的时候，种植组件多个平行设置，上述蘑菇的种植为间隔行播，每个条带的蘑菇之间设有与条带平行的轨道，传感器为为红外或者激光探头或其他频率探头，具体实施时，为降低开发成本，本实施例中使用杭州思看科技有限公司的激光三维扫描仪改造而成，将其输出接口通过数据线与控制器相连并将生成的三维数据输入控制器，控制器的数据处理模块自动获取并计算菌幕布的高度，当所述内菌幕形成的圆环宽度l为所述菌柄173直径的0.2-0.5倍，当高度h大于0.2-0.5mm则判断此时该蘑菇处于内菌幕初现期，同时控制器记录该位置蘑菇的坐标点；控制器之后控制蘑菇切割装置的电动推拉杆前移，盘刀5将该蘑菇17切断，推板12推动蘑菇17并推到到收集框4中。使用本发明提供的方法，能够高效率的完成蘑菇处于内菌幕初现期的判断，避免通过人工肉眼观察，大大提高了育种获取双孢蘑菇担孢子同核体的效率

实施例3

结合实施例1和实施例2，阐述研究方法如下：

供试菌株：双孢蘑菇w192引自福建省农业科学院

扫描电子显微镜制样：a取样。将双孢蘑菇子实体发育过程可分为7个时期,分别为原基期、菇蕾期、幼菇期、小菇期、采收期、成熟期、开伞期。为了增加研究的针对性，本研究选取采收期双孢蘑菇，本研究将采收期双孢蘑菇细分为5个时期分别为：内菌幕未现期、内菌幕出现期、内菌幕内凹期、内菌幕平坦期、内菌幕裂缝期（图1）。a:放入2.5%的戊二醛固定液中4℃浸泡12h。b:倒掉固定液，随后用0.1m磷酸缓冲液（ph7）漂洗15min，该步骤重复3次。c:倒掉漂洗液，用1%饿酸溶液再固定2h。d:倒掉固定液，随后用0.1m磷酸缓冲液（ph7）漂洗15min，该步骤重复3次。e:利用梯度酒精脱水（50%、70%、80%、90%、95%各处理15min；100%处理20min）。f:将脱水后的样品放入乙醇和乙酸乙戊酯(v/v1:1)混合液处理30min，而后用纯乙酸乙戊酯处理1h。g:将样品放入干燥仪临界点干燥仪。h:利用离子溅射仪在样品表面喷上一层导电金。

置于扫描电子显微镜观察担子形态。将处理过的菌褶平放到粘有导电性和粘性的炭膜的扫描电子显微镜样品台上。统计不同发育阶段菌褶上发育出孢子梗的担子数量及不同担子的比例。

图1中依次为内菌幕未现期、内菌幕初期、内菌幕内凹期、内菌幕平坦期、内菌幕裂缝。箭头所指为内菌幕。图中比例尺为1cm

3研究成果

3.1对担子不同发育时期观察发现，担子密集地排列在菌褶的表面，统计20张显微照片中发育出孢子梗的担子数目如图1，显微镜照片放大倍数为3000倍，视野中面积1021为µm2。

3.2对不同发育时期的菌褶中发育出孢子梗的担子进行统计分析如图2。

对多个内菌幕未现期的菌褶观察发现，该时期菌褶中没有发育出孢子梗的担子。内菌幕初现期的的菌褶观察发现，该时期有少量担子发育出孢子梗，平均每1021um2的菌褶面积中平均有1.2个担子发育出孢子梗，随机选择48个发育出孢子梗的担子进行统计发现，其中2孢担子的比例为25.0%，3孢担子的比例为75.0%，经计算，该时期同核体孢子率为28.6%，菌褶上但未见已脱落担孢子。内菌幕凹期的菌褶中每1021um2的菌褶面积中平均有3.4个担子发育出孢子梗，随机选择457个发育出孢子梗的担子进行统计发现，其中2孢担子的比例为12.0%，3孢担子的比例为87.7%，经计算该时期同核体孢子率为13.2%，可见已脱落担孢子。

内菌幕平坦期的菌褶中每1021um2的菌褶面积中平均有4.6个担子发育出孢子梗，随机选择414个发育出孢子梗的担子进行统计发现，其中3孢担子的比例为7.0%，2孢担子的比例为92.8%，经计算该时期同核体孢子率为7.7%，菌褶中存在少量已脱落担孢子。内菌幕裂缝期的菌褶中每1021um2的菌褶面积中平均有9.6个担子发育出孢子梗，随机选择643个发育出孢子梗的担子进行统计发现，其中3孢担子的比例为5.9%，2孢担子的比例为93.9%，经计算该时期同核体孢子率为6.2%，菌褶中存在较多已脱落担孢子。

3.3经计算，各时期所得孢子同核率如图3。该结果明显有异于elliott对双孢蘑菇担子种类的统计结果(elliottetal,1983)，即双孢担子产生概率为95%，三孢担子产生概率为4.5%，四孢担子产生概率为0.5%。采用孢子印法获得担孢子的时期选择通常是内菌幕平坦期及内菌幕裂缝期，而此时期的同核体孢子频率为明显低于内菌幕初现期和内菌幕内凹期，以此结果为借鉴，选取菌环出现期的双孢蘑菇子实体进行孢子收集和萌发较菌膜平坦期而言将显著提高双孢蘑菇的同核体筛选效率约8倍。

上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。