本发明涉及紫花三叉白芨组织培养
技术领域：
，具体涉及一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法。
背景技术：
：白芨又名连及草，甘根、白给、朱兰、紫兰等为兰科白芨属多年生草本球茎植物，白芨的药用部分分为干燥块茎，其性平、微寒，味苦、甘、涩，有收敛止血功效，主要用于吐血、外伤出血、皮肤皲裂等，白芨品种大致分为两个大类，一类为紫花白芨，花紫红色，叶披针或广披针形，先端渐尖，基部下延成鞘状抱茎，包含大种、小种两小类，另一类为黄花白芨，其花黄色，叶条状披针形，紫花三叉白芨的供需量差额太大，造成大量采集和消耗植物资源，再加上南方各省的丘陵山区森林覆盖率进一步加大，也可加剧野生白芨产量年年下降，当采集和消耗量超过自然资源的再生能力时，会导致物种的濒危。现有紫花三叉白芨种子无菌诱导其植株再生技术还未完全成熟，在组培过程中种子感菌率较高，同时种子萌发率较差，因此本发明针对这一现状进一步的研究，完善无菌诱导植株再生技术。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理6-10min，随后采用无菌蒸馏水冲洗4-6次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理30-40s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。作为本发明的进一步方案是：所述步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌5-15min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为10-20％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量70-80％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。作为本发明的进一步方案是：所述蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过20-100目筛，随后进行水浴加热，加热温度为65-75℃，加热25-35min，随后再超声分散15-25min，即可。作为本发明的进一步方案是：所述步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量2.0-3.0kgy，辐照计量率为20-30gy/min。作为本发明的进一步方案是：所述步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量2.5kgy，辐照计量率为25gy/min。作为本发明的进一步方案是：所述培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为55-65％，时间为12h/d。作为本发明的进一步方案是：所述增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。作为本发明的进一步方案是：所述生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，相对于常规技术中，本发明在杀菌过程中，先在70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理，杀菌液采用石墨烯溶液、壳聚糖、蒙脱土分散液以及高锰酸钾组成的杀菌液，该杀菌液采用无机原料组成，杀菌效率高，且绿色环保，易被清洗，随后再通过辐照处理，可诱发种子，提高种子活跃性，进而促进种子萌发，采用的增殖培养基、生根培养基可提高紫花三叉白芨种子在后期生根等生理状况，本发明的种子萌发率达到98.9％，感菌率达到0.1％，可知，本发明相对于常规的组培方法改善效果很显著。具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：本实施例的一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理6min，随后采用无菌蒸馏水冲洗4次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理30s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。本实施例的步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌5min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为10％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量70％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。本实施例的蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过20目筛，随后进行水浴加热，加热温度为65℃，加热25-35min，随后再超声分散15min，即可。本实施例的步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量2.0kgy，辐照计量率为20gy/min。本实施例的培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为55％，时间为12h/d。本实施例的增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。本实施例的生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。实施例2：本实施例的一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理10min，随后采用无菌蒸馏水冲洗6次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理40s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。本实施例的步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌15min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为20％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量80％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。本实施例的蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过100目筛，随后进行水浴加热，加热温度为75℃，加热35min，随后再超声分散25min，即可。本实施例的步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量3.0kgy，辐照计量率为30gy/min。本实施例的培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为65％，时间为12h/d。本实施例的增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。本实施例的生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。实施例3：本实施例的一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理6-10min，随后采用无菌蒸馏水冲洗5次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理30-40s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。本实施例的步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌10min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为15％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量70-80％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。本实施例的蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过60目筛，随后进行水浴加热，加热温度为70℃，加热30min，随后再超声分散20min，即可。本实施例的步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量2.5kgy，辐照计量率为25gy/min。本实施例的培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为60％，时间为12h/d。本实施例的增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。本实施例的生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。实施例4：本实施例的一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理4min，随后采用无菌蒸馏水冲洗3次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理25s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。本实施例的步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌5-15min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为8％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量70-80％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。本实施例的蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过10目筛，随后进行水浴加热，加热温度为60℃，加热20min，随后再超声分散10min，即可。本实施例的步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量1.8kgy，辐照计量率为15gy/min。本实施例的培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为40％，时间为12h/d。本实施例的增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。本实施例的生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。实施例5：本实施例的一种紫花三叉白芨种子无菌诱导植株再生的组培方法，包括以下步骤：步骤一，选取颗粒饱满、色泽正常、大小均一、生长健壮的紫花三叉白芨种子，先用去离子水冲洗3min，随后置于70％酒精中浸泡5min，再移置杀菌液中处理12min，随后采用无菌蒸馏水冲洗7次，置于无菌环境中备用；步骤二，将步骤一备用的种子先进行辐照处理，处理45s，随后接种于初代培养基ms上，置于培养室，30d后观察萌芽和生长状况；步骤三，将步骤二萌发的无菌幼苗转移到增殖培养基中，60d后再转移到生根培养基中，培养40d后，再炼苗移栽，即可。本实施例的步骤一中杀菌液制备方法为将石墨烯粉、去离子水按照3:7进行混合搅拌，配制成石墨烯溶液，随后加入石墨烯溶液总量10％的壳聚糖溶液，继续搅拌20min，至壳聚糖充分溶解，随后再加入质量分数为25％的高锰酸钾溶液，最后加入壳聚糖总量85％的蒙脱土分散液，搅拌均匀，即可。本实施例的蒙脱土分散液制备方法为将蒙脱土进行研磨，过120目筛，随后进行水浴加热，加热温度为80℃，加热40min，随后再超声分散30min，即可。本实施例的步骤二中辐照处理条件为采用紫外线辐照，辐射总剂量3.5kgy，辐照计量率为35gy/min。本实施例的培养室条件为光照强度为2000lx，湿度为70％，时间为12h/d。本实施例的增殖培养基为ms+6-ba1.2mg/l+iba0.1mg/l+ga31.5mg/l。本实施例的生根培养基为1/2ms+ac0.05g/l+iba1.0mg/l+蔗糖15g/l。对比例1.与实施例3的材料及制备工艺基本相同，唯有不同的是未经过杀菌液处理。对比例2.与实施例3的材料及制备工艺基本相同，唯有不同的是杀菌液未添加蒙脱土。对比例3.采用常规组培方法。实施例1-5及对比例1-3性能测量结果如下感菌率(％)萌发率(％)实施例10.598.1实施例20.798.4实施例30.198.9实施例41.397.6实施例51.697.3对比例13.292.3对比例22.493.5对比例35.490.2从实施例1-5及对比例1-3中得出，本发明的组培方法相对于对比例1-3，感菌率、萌发率都有大幅度改善，可知，本发明相对于常规的无菌诱导植株再生技术，得到很大完善。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12