本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种快速繁殖水生植物水鳖优质种苗的方法和应用。
背景技术：
水鳖(hydrocharisdubia(bl.)backer)为水鳖科水鳖属一种多年生浮水植物，叶多漂浮，密集时也有挺出水面，常生长于静水池沼中。水鳖具有较强的水质净化能力，近年来随着中国大量湿地生态修复工程的实施，该植物种苗的市场需求量极大。另外水鳖植株尤其是其叶片具有较高的观赏价值，其叶色翠绿，呈心型或圆形，叶背面有凸起的蜂窝状贮气组织。水鳖花瓣3片，白色。该植物在小型家庭水族观赏布景和大型湿地公园水景设计中也具有很高的地位。
由于水鳖种子很难收集，现有市场所需种苗的获得主要依靠其休眠芽和自然分株繁殖，相关种源采集受季节限制，所得种苗大小往往参差不齐，劳动力成本高而收获效率极低。尤其是现有湿地生境大量丧失的情况下，野生水鳖种源已很难找到。另外，野生水鳖因极易遭受病虫害的侵袭，其叶片多带虫斑，直接移入景观水体和水族缸中时不仅影响观赏效果，还容易引发病菌扩散，危害水体中其它动植物的安全。
迄今国内外未见有关水鳖脱毒苗的培养及其优质种苗大规模人工繁殖的研究与报道。
技术实现要素：
本发明的目的是：提供一种可利用室内人工条件大规模生产水鳖优质种苗的组培快繁方法和应用。
本发明的技术方案：
本发明所提供一种水鳖优质种苗的快繁繁殖和应用方法，包括以下步骤：
(1)脱毒母本的获得
从野外自然湿地中采集水鳖植株少量，剪取带有分蘖芽的茎段，于洗涤液中浸洗0.5～2h后，用自来水冲洗干净。在超净工作室中，用70％～75％乙醇浸泡不超过3min，改用含0.2％～1％有效氯的naclo溶液或1～5％的h2o2消毒液浸泡消毒10s～5min或0.05％～1％的hgcl2消毒液浸泡消毒1～30min，再用无菌水彻底漂洗干净。将材料进一步切割整理后接种于装有已灭菌培养液①的三角瓶中，并以透气封口膜封口，置于专用组培架上培养。维持平均光照强度1000～5000lx，每日光照8～12h左右，室内温度20～30℃。一个月后挑出有新芽长出且无细菌生长的材料即水鳖脱毒母本。所述培养液①为：1/2～1倍的ms+10～40g/l的蔗糖+0.5～3.0mg/l的细胞分裂素kt或6-ba+0.1～1.0mg/l的生长素iaa或iba,调ph至5.6～6.2之间。
(2)丛生芽的扩增
取上述步骤1所得水鳖脱毒母本，于无菌操作台上转接入已灭菌的培养液②中。将三角瓶放回原组培架上培养15～30d，待水鳖丛生芽基本长满整瓶时取出，每1～3芽切割分瓶，并继续扩繁。所述培养液②为：1/2～1倍的ms+10～40g/l的蔗糖+0.5～3.0mg/l的细胞分裂素kt或6-ba+0.1～1.0mg/l的生长素iaa或iba+5～10％的椰子汁,调ph至5.6～6.2之间。
(3)生根与完整植株的诱导
取上述步骤2所得水鳖丛芽，于无菌操作台上以每1～2个芽切割分离，转接入已灭菌的培养液③中。将三角瓶放回原组培架上培养15～30d，等待瓶中水鳖生根并形成完整幼苗。所述培养液③为：1/4～1倍的ms+7.5～30g/l的蔗糖+0.01～0.5mg/l的生长素naa或iba,调ph至5.6～6.2之间。
(4)壮苗与移栽
将上述步骤3所得水鳖幼苗从三角瓶中取出，若准备应用于室内水族缸中，则根据水族缸栽培的无菌要求，先以无菌水、去离子水或自来水冲洗以去除材料表面残余培养液，然后在无菌或有菌条件下将组培苗投入水族缸中即可。若准备应用于湿地公园建设或湿地生态恢复等室外大型工程，则将组培苗先过自来水冲洗，清除ms和激素残余后转入含稀释hoagland营养液的开放水培箱中，并置于温室或室外壮苗2～4周。初期若遇室外光照过强，可用遮阳网等挡去1/2左右太阳光。3～7d后组培苗能完全适应自然光。水鳖组培苗的大规模移栽可采用两种方式。其一为直接抛撒入自然水体使其漂浮生长，初期也可以围栏圈围防止其漂走。其二为先栽入以塘泥、泥炭土等为主要成分的基质中，然后再移入浅水水体，这样定植更快，但初栽时水位深度不宜超过1m。
本发明的有益效果为：
(1)获得了水鳖脱毒母本。野外采集到的水鳖种苗本身带有大量病菌和污染物，直接放入水族缸中培养容易给缸内的观赏鱼类等其他生物带来传染危险，并将导致水质恶化。即使用于室外湿地造景或湿地生态恢复中也经常因病菌污染而影响水鳖的建群效果。本技术先采用较温和的洗涤剂浸洗，初步去除污染物后，再以乙醇+naclo、h2o2、hgcl2等消毒剂进行二步消毒，以达到彻底灭菌效果。通过此消毒程序，水鳖材料无菌率达50％以上，其中无菌材料在ms培养液①中的再生率50％以上。新生出来的幼芽即为后续水鳖扩繁所用脱毒母本。
(2)建立了水鳖优质种苗的快速繁殖技术。本技术在上述水鳖脱毒母本的基础上，通过培养液②直接诱导出大量水鳖丛生芽，其新芽月扩繁率可达1:30以上。需要完整幼苗时，将新生芽切下转入培养液③即可诱导生根，并形成完整植株，其生根率达95％以上。本技术不需要大面积场地空间，所用试剂原料均为常规化工产品，成本低廉，便于大规模工厂化生产。
(3)本发明不受野外自然环境的限制，可不分季节随时为室内水族观赏布景提供优质水鳖脱毒种苗；也可在自然资源匮乏的情况下，为湿地公园建设、湿地生态恢复等大型工程批量提供规格一致的优质水鳖种苗。
采用该方法不受植物自然物候规律的影响，投入成本低，繁殖效率高，种苗健壮且规格统一，可实现全年度工厂化批量生产。所得水鳖优质种苗可满足湿地公园建设及湿地生态恢复工程中大批量浮叶植物种苗的需求，也可满足室内观赏水族布景中高规格脱毒浮叶观赏植物的需求。
具体实施方式：
实施例1.2015年11月初于江苏常熟南湖采得水鳖10株，取其带芽点的嫩茎20个，经洗涤剂浸泡1h后，自来水冲洗2h。于超净工作室中，以70％乙醇浸泡20s，再以0.2％hgcl2浸泡30min,无菌水彻底冲洗干净。接种到含1/2ms+15g/l蔗糖+2.0mg/lkt+0.5mg/liaa、ph＝5.60的培养液①中培养。期间维持光照强度2000lx，每日光照8h，室内温度25℃左右。1个月后发现该批材料无菌率为60％，其中8个无菌材料再生出脱毒幼芽。取其中4个脱毒幼芽，转接入含1/2ms+15g/l蔗糖+2.0mg/lkt+1.0mg/liaa+10％椰子汁、ph＝5.75的培养液②中诱导丛生芽。经过2次转接后，将所有芽分割，转入含1/4ms+7.5g/l蔗糖+0.01mg/lnaa、ph＝6.05的无菌培养液③中。又经1个月，将所有材料取出，共获得根系发达的水鳖健壮组培苗约4000株。取其中1000株，以无菌水冲洗去除表面残余培养液，用于家庭观赏用水族布景。剩余组培苗经自来水冲洗后转入400l塑料水箱中，给予1/10hoagland营养液壮苗。该塑料水箱存放于玻璃温室中，光照约为室外自然光的30％～70％,温度维持在25℃左右。经20d壮苗后，进一步长大的水鳖组培苗被直接漂浮于我校校园河道中，用于湿地景观建设。该批水鳖组培苗中，用于水族缸中观赏布景的种苗成活率为100％，未见污染现象；用于校园景观湿地中的种苗也在当年夏季成功建群并开花。
实施例2.2016年10月,于南京仙林湖采得水鳖5株，取其带芽点的嫩茎10个，经洗涤剂浸泡30min后，自来水冲洗30min。于超净工作室中，以75％乙醇浸泡1min，再以1:10稀释的商用漂白剂(naclo溶液)浸泡2min,无菌水彻底冲洗干净。接种到含1/2ms+15g/l蔗糖+2.0mg/l6-ba+0.5mg/liba、ph＝5.82的培养液①中培养。培养室条件为光照强度1500lx，每日光照10h，室内温度25℃左右。1个月后发现该批材料中有6个无菌，其中5无菌材料再生出脱毒幼芽。取该脱毒幼芽，转接入含1倍ms+30g/l蔗糖+3.0mg/l6-ba+1.0mg/liba+5％椰子汁、ph＝6.05的培养液②中诱导丛生芽。经过3次转接后，将所有丛生芽分割，除少量保种的继续转入培养液②中，剩余全部转入含1/2ms+15g/l蔗糖+0.5mg/lnaa、ph＝6.12的无菌培养液③中。又经25d，将已生根材料取出，经自来水冲洗后转入1/2hoagland营养液中壮苗。20d后清点共获水鳖健壮组培苗10万余株。该批组培苗被应用于江苏常熟南湖湿地公园中水质的净化。其中2000株左右健康组培苗先栽入塘泥基质，再移入水深50cm左右的池塘浅水区域。剩余组培苗直接抛撒入圈围的河道中。2周后观察水鳖组培苗野外生存状况，发现两种移栽方式的种苗都已恢复生长，密集区域水鳖覆盖度超过80％。