一种分子标记辅助选择高抗稻瘟病水稻材料的方法与流程

本发明涉及一种分子标记辅助选择高抗稻瘟病材料的选育方法，尤其是采用特异性的分子标记辅助选择含稻瘟病抗性基因的水稻材料，结合田间表型性状和抗病性鉴定，选育目标更加明确高效，属于水稻育种领域。

背景技术：

稻瘟病是由稻瘟病菌引起的水稻病害，其分布范围十分广泛。据统计，全世界有80余个国家均有发生，一般流行年份可造成10％-20％的减产，严重发生时则达到40％-50％。20世纪90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm²以上，每年损失稻谷数亿千克。随着品种应用的单一化、集中化以及气候的影响，稻瘟病的危害也越来越严重。尽管人们在防害防治上耗费了巨大的精力和物质投入，但限于诸多方面因素的影响，防治效果一直不尽人意，尤其在病害严重发生的年份，常常给生产育种造成了巨大的损失。以吉林省为例，吉林省主栽水稻品种吉粳88，近年来由于品种抗病性退化导致穗茎瘟大面积发生，严重影响了北方粳稻的生产。产生这种现象的根本原因就是主栽品种对稻瘟病病苗的抗谱狭窄，且单一化，集中化种植普遍，这样一旦稻瘟病病菌流行小种发生变化，品种对稻瘟病的抗性便迅速下降。因此选育广谱抗性的水稻品种很重要。

目前，在抗稻瘟病品种选育过程中，育种家主要采用系谱法。传统的系谱法通过两亲本组配，从分离后代中择优选育品种，抗病表型依赖于田间自然鉴定或人工接种鉴定，鉴别难度大，准确率很低。由于不了解亲本的抗病基因型，育种者在亲本选择上非常盲目，通常是海量配组，海量选择后代，工作量大，育种效率低。利用分子标记结合田间抗病表现进行选择，可以大大提高抗性品种选育的准确性和效率。

水稻稻瘟病抗性基因pi40源自澳洲野生稻(o.australiensits)主效抗病基因，对来自我国东北吉林省的稻瘟病菌表现较强的抗性。pi40(t)初步定位于水稻第6号染色体短臂上的dna标记s2539和rm3330之间，遗传距离分别为3.8cm和2.4cm；通过电子着陆(e-landing)技术，在水稻pseudomolecule3上1.8mb的重叠群(conting)中鉴定出14个bac/pac克隆，为6个nbs-lrr结构设计的引物位于pac克隆p0649c11中。dna标记p1、p2与pi40紧密连锁。

技术实现要素：

为了高效选择高抗稻瘟病新品种，有针对性、特异性的选择含有pi40基因后代的材料，本发明提供了一种有效的选育方法。利用dna标记p1和p2对抗稻瘟病性基因pi40进行分子标记辅助选择，结合田间不同分离世代的性状选择及抗性鉴定，以提高选育抗病新材料的效率。

本发明提供以下解决方案：

利用含有稻瘟病抗性基因pi40的水稻材料ng13与感病材料吉粳88构建抗感f2群体。利用特异分子标记p1、p2筛选含田间表型性状优良且含有pi40的单株，利用筛选出的单株再与感病亲本吉粳88进行回交，得到回交群体bc1f1在海南进行加代；在天津正季播种bc1f2的种子，再次利用分子标记p1、p2对稻瘟病抗性基因pi40进行筛选，同时结合田间表型筛选及抗病性鉴定筛选抗病单株，利用抗病单株再与感病亲本吉粳88进行回交，得到bc2f1群体在海南加代；在天津正季播种bc2f2种子，利用分子标记p1、p2对稻瘟病基因pi40进行筛选，筛选出的抗病单株一部分自交加代，另一部分继续与感病亲本吉粳88进行回交；天津正季得到的回交群体bc3f1在海南加代，天津正季对bc3f2的单株继续进行抗病基因检测，筛选含有抗病基因的单株，bc2f3的种子继续加代检测。在bc2f4代与bc3f4代时单株收种并进行抗病基因的筛选，入选的单株进行扩繁试种，挑选出田间表型与吉粳88相似，含有稻瘟病抗性基因pi40并抗病性较好的新品系。

一种检测稻瘟病抗性基因pi40是否存在的引物对，如p1和p2。p1引物序列为5’-caacaaacgggtcgacaaagg-3’，p2引物序列为5’-cccccaggtcgtgataccttc-3’。

一种检测水稻dna中是否存在水稻稻瘟病抗性基因pi40的方法，以p1和p2所示序列为引物，扩增待检测dna。扩增产物含有ng13的条带即为含有水稻稻瘟病抗性基因pi40，如图1第1个孔所示。

一种抗稻瘟病材料的选育方法，以含有水稻稻瘟病抗性基因pi40的水稻材料为亲本，与感病水稻品种进行杂交，对杂交后代f2分离群体单株提取基因组dna，以p1和p2所示序列为引物进行pcr扩增，结合田间抗病性及表型鉴定，筛选含有稻瘟病抗性基因pi40并抗病性较好的单株。

上述引物对优选对水稻苗期所提取的dna进行标记鉴定，检测是否携带稻瘟病抗性基因pi40，此引物鉴定结果结合田间抗病检测进行验证，准确率较高。该引物对可以作为水稻抗稻瘟病育种中pi40基因的分子标记。

附图说明

图1是分子标记p1、p2在稻瘟病抗性基因pi40的抗性亲本ng13和感病品种吉粳88及后代分离群体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图：

m：2000bp分子量标记(片段长度分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250，100bp)

1；ng132；吉粳883，5，7，9，10，11为感病单株带型；4，6，8，12为抗病单株带型

具体实施方式

实施例1：含稻瘟病抗性基因pi40的抗性亲本与感病亲本吉粳88杂交构建抗感群体以及后代群体的鉴定筛选

含稻瘟病抗性基因pi40的抗性亲本ng13与感病亲本吉粳88杂交，再自交，然后自交f2代进行性状筛选及抗稻瘟病病基因pi40筛选，选择株高、生育期、丰产性等与吉粳88相似且含有抗病基因pi40的f2单株50株；然后与感病亲本吉粳88第一次回交，自交得到bc1f2，再进行性状筛选及抗病基因pi40的筛选，选中性状优良且含有抗病基因pi40的bc1f2单株50株；然后与感病亲本吉粳88进行第二次回交，自交得到bc2f2，再进行性状筛选及抗病基因pi40的筛选，选中性状优良且含有抗病基因的bc2f2单株一部分自交加代，另一部分再与感病亲本吉粳88进行第三次回交，自交得到bc3f2，再进行田间表型筛选及抗病基因pi40的筛选，选择性状优良且含有抗病基因的bc3f2单株进行自交；bc2f2自交后代及bc3f2自交后代中，都进行田间表型性状筛选及抗病基因pi40鉴定。到bc2f4及bc3f4，选择含有抗病基因且表型优良的株系，当地扩繁、测产、考种及稻瘟病抗性总体鉴定，按照整个育种流程可以选育出抗稻瘟病的新品系。

实施例2：抗感单株dna提取、pcr扩增和电泳分析

一、dna提取(ctab法)

称取0.1～0.2g水稻叶片并剪成1cm长，放65℃预热过的提取液(1mtrisph8.0，100mm：5mnacl，1.0medta，20mm：10％ctab，2.0％)800μl的离心管中。放入组织研磨仪中，频率57.0hz，转速1710n，震动200s。65℃水浴30min，每10min轻巧摇动均匀。加入等体积的酚氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，温和摇动，使成乳状液。室温下(温度不低于15℃)，12000r/min离心10min，取上清液。小心抽取上清液450μl，加入预冷的2倍体积的无水乙醇(或等体积的异戊醇)，-20℃条件下放置20min以上，5000r/min离心5min，收集沉淀。70％乙醇洗涤沉淀1～2次。打开管盖，放洁净场所晾干，乳白色的dna沉淀透明即可。最后加100μlte(tris-hcl110mm，ph8.0；edta1mm，ph8.0)溶解沉淀，稀释至100μg/ml，-20℃保存备用。

二、pcr扩增：

1.pcr反应体系：2×taqpcrmastermix10μl，10μm的引物各0.5μl，100ug/ml的模板dna1μl，ddh2o8μl。

2.pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃30s，65℃30s，72℃1min，循环35次；72℃延伸10min，4℃保存。

三、pcr检测

3％琼脂糖凝胶电泳检测结果，加样6μlpcr产物，经goldview染色，应用凝胶成像系统进行拍照。

实施例3：将含稻瘟病抗性基因pi40的抗病品种ng13、感病品种吉粳88及抗感群体单株种植于稻瘟病高发区吉林省松原市，经自然条件诱发稻瘟病，在苗期和成熟期分别进行叶瘟和穗茎瘟的的抗性调查，统一标准进行评定。

1.叶瘟田间鉴定

叶瘟调查记载标准：

0级无病…………………………………………………………………高抗(hr)

1级病斑为针头状大小褐点……………………………………………抗(r)

2级稍大褐点……………………………………………………………抗(r)

3级圆性至椭圆形的灰色病斑，边缘褐色，病斑直径约1～2毫米……中抗(mr)

4级典型纺锤形病斑，长1～2厘米，通常局限在二条叶脉之间，为害面积不超过叶面积的2％……中感(ms)

5级典型纺锤形病斑，为害面积不超过叶面积的10％…………………中感(ms)

6级典型纺锤形病斑，为害面积10.1～25％……………………………感(s)

7级典型纺锤形病斑，为害面积25.1～50％……………………………感(s)

8级典型纺锤形病斑，为害面积50.1～75％……………………………高感(hs)

9级全部叶片枯死………………………………………………………高感(hs)

田间自然诱发后，对吉林省松原地区流行的稻瘟病叶瘟进行鉴定。结果表明，稻瘟病抗性基因pi40供体亲本ng13及4号、6号、8号、12号抗病单株表现抗病(r)，而当地主栽感病品种吉粳88高感，3号、5号、7号、9号、10号、11号单株表现为感病(s)。

2.穗颈瘟田间鉴定

穗茎瘟病穗率评价分级标准

0级无病…………………………………………………………高抗(hr)

1级病穗率低于1～5％…………………………………………抗(r)

3级病穗率在5.1～10％………………………………………中抗(mr)

5级病穗率在10.1～25％………………………………………中感(ms)

7级病穗率在25～50……………………………………………感(s)

9级病穗率在50.1～100％……………………………………高感(hs)

田间自然诱发后，对吉林省松原地区流行的稻瘟病穗颈瘟进行鉴定。结果表明，稻瘟病抗性基因pi40供体亲本ng13及4号、6号、8号、12号抗病单株表现抗病(r)，而当地主栽感病品种吉粳88高感，3号、5号、7号、9号、10号、11号单株表现为感病(s)。

在苗期按实施例2所述方法提取基因组dna，以p1和p2为引物进行pcr扩增，扩增结果如图1所示：稻瘟病抗性基因pi40供体亲本ng13及抗病单株的带型含200bp及120bp两条带，感病亲本吉粳88及感病单株的带型含250bp及200bp两条带。

由此得出，利用分子标记p1、p2可以较好的鉴定稻瘟病抗性基因pi40，含有pi40基因的材料田间表现抗性较好，不含有pi40基因的材料田间表现感病。