双氯芬酸钠在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用的制作方法

本发明属于农业生物技术领域，涉及杀菌活性化合物，特别涉及双氯芬酸钠在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。

背景技术：

进入新世纪，资源短缺、环境污染、生态破坏以及自然灾害频繁等问题日益突出，严重阻碍了农业的可持续发展，农业生产也因此承担前所未有的巨大压力。根据联合国粮农组织估计，全世界的粮食和棉花生产因病害常年损失在10％以上。植物病害不仅可引起农作物产量的减少，而且在一定程度上还严重威胁到农产品的质量安全及其国际贸易。

目前，对植物病害的防治的最为有效是化学防治。但是大量使用化学药物容易造成农药残留问题以及病原真菌的抗药性问题，并且对生态环境造成污染。因此，必须研发出高效、低毒、低残留和环境友好型的杀菌剂，并将其应用于生产实践中。我国农业要向着健康可持续方向发展，解决抗性、增强植物免疫能力、安全高效、与环境兼容性好等问题已经成为杀菌剂产品发展的方向。

双氯芬酸钠，中文别名：2-[(2，6-二氯苯基)氨基]-苯乙酸钠、二氯芬酸、双氯灭痛钠、双氯灭痛、二氯苯胺苯乙酸钠、双氯胺苯乙酸钠；英文名称：diclofenacsodiumsalt；英文别名：2-[(2，6-dichlorophenyl)amino]benzeneaceticacidsodiumsalt；cas号：15307-79-6；分子式：c14h10cl2nnao2；分子量：318.13。分子结构式为：

双氯芬酸钠，白色结晶性粉末，是一种非甾体类抗炎药(nsaid)，药用名称服他灵、阿米雷尔等。双氯芬酸钠镇痛和抗炎作用的基础是抑制环氧合酶(cox)抑制剂。双氯芬酸钠还具有清除自由基的功能，并在使被辐射损伤的dna恢复有保护作用，是一种潜在的辐射保护剂。双氯芬酸钠一般用于缓解类风湿关节炎、骨关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎、风湿性关节炎等各种关节炎的关节肿痛症状；用于治疗非关节性的各种软组织风湿性疼痛、如肩痛、腱鞘炎、滑囊炎、肌痛及运动后损伤性疼痛等；用于急性的轻、中度疼痛如：手术后、创伤后、劳损后、痛经、牙痛、头痛等；对发热有一定的解热作用。由于使用浓度极低，在通常使用条件下是安全无毒的。

目前，国内外尚无关于双氯芬酸钠对农业植物病原菌抑制作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了双氯芬酸钠在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。本发明通过毒力测定，证明了双氯芬酸钠对植物病原真菌具有良好的抑制活性。双氯芬酸钠作为杀菌剂，其高效、低毒，适合于植物病害化学防治的要求。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了双氯芬酸钠在制备用于防治由植物病原菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。

进一步的：所述植物病原菌为半知菌亚门真菌与子囊菌亚门真菌。

进一步的：所述杀菌剂中双氯芬酸钠的有效使用浓度为0.5mm-1.5mm。

进一步的：所述半知菌亚门真菌包括：蓝莓拟茎点枝枯病菌、蓝莓枝枯病菌、花生黑斑病菌、番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯枯萎病菌、烟草靶斑病菌、棉花黄萎病菌、玉米弯孢叶斑病菌、黄瓜棒孢叶斑病菌。

进一步的：所述子囊菌亚门真菌包括：苹果炭疽叶枯病菌、蓝莓枝干溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、梨腐烂病菌。

进一步的：所述杀菌剂中双氯芬酸钠的浓度为1.5mm时，双氯芬酸钠对蓝莓拟茎点枝枯病菌、花生黑斑病菌、烟草靶斑病菌、棉花黄萎病菌、黄瓜棒孢叶斑病菌、苹果炭疽叶枯病菌、苹果轮纹病菌、蓝莓枝干溃疡病菌和苹果腐烂病菌的抑制率超过90％。

进一步的：所述植物为苹果、梨、番茄、蓝莓、烟草、黄瓜、棉花、玉米、小麦、马铃薯和花生。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：目前防治植物病原菌主要靠农药。农药杀菌剂的品种作用机制比较单一，并且滥施农药带来“3r”问题，即有害生物抗药性(resistanee)、有害生物再猖撅(resurgenee)和农药残留(residue)，直接威胁着人类的环境和食品安全。因此，开发是应用无污染、无公害绿色杀菌剂已成为农业生产中的重要防治方法。许多绿色杀菌剂已相继问世，并广泛应用于生产，取得了显著效果。本发明通过室内毒力测定，证明了双氯芬酸钠对植物病原真菌具有良好的抑制活性。而且双氯芬酸钠是一种可降解、无污染、对环境友好的小分子化合物，并且其抗药性差、对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品及果蔬的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

附图说明

图1是本发明中双氯芬酸钠对蓝莓拟茎点枝枯病菌的抑菌实验结果；

图2是本发明中双氯芬酸钠对蓝莓枝枯病菌的抑菌实验结果；

图3是本发明中双氯芬酸钠对花生黑斑病菌的抑菌实验结果；

图4是本发明中双氯芬酸钠对番茄早疫病菌的抑菌实验结果；

图5是本发明中双氯芬酸钠对番茄灰霉病菌的抑菌实验结果；

图6是本发明中双氯芬酸钠对小麦赤霉病菌的抑菌实验结果；

图7是本发明中双氯芬酸钠对马铃薯枯萎病菌的抑菌实验结果；

图8是本发明中双氯芬酸钠对烟草靶斑病菌的抑菌实验结果；

图9是本发明中双氯芬酸钠对棉花黄萎病菌的抑菌实验结果；

图10是本发明中双氯芬酸钠对玉米弯孢叶斑病菌的抑菌实验结果；

图11是本发明中双氯芬酸钠对黄瓜棒孢叶斑病菌的抑菌实验结果；

图12是本发明中双氯芬酸钠对苹果炭疽叶枯病菌的抑菌实验结果；

图13是本发明中双氯芬酸钠对梨腐烂病菌的抑菌实验结果；

图14是本发明中双氯芬酸钠对苹果轮纹病菌的抑菌实验结果；

图15是本发明中双氯芬酸钠对蓝莓枝干溃疡病菌的抑菌实验结果；

图16是本发明中双氯芬酸钠对苹果腐烂病菌的抑菌实验结果；

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

实施例1

一、实验材料

双氯芬酸钠购买的自sigma公司。称取3.18g双氯芬酸钠于100ml的二甲基亚砜中，配成0.1m的母液，过滤除菌4℃保存待用。

本实验中植物病原菌保存在4℃冰箱，采用的培养基为马铃薯葡萄糖培养基(简称pda)。

pda培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂15g，自来水1000ml，自然ph。

配制方法：将马铃薯洗净去皮，称200g切成小块，加水煮烂(煮沸15-20分钟)，用八层纱布过滤于烧杯中，根据实验需要加15-20g琼脂，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，充分溶解后稍冷却补足水至1000ml，分装后121℃灭菌20分钟，冷却后备用。

二、实验方法

采用生长速率法。

1、先将16种植物病原菌在pda平板上25℃培养6d左右待用。

2、将pda培养基加热溶化，冷却至45-50℃，分别加入不同浓度的双氯芬酸钠制成含0、0.5、1.0和1.5mm药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却。

3、以无菌操作手续，用打孔器在培养6d的各菌株菌丝边缘(生长状况尽量一致)打取圆形菌饼(直径0.60cm)，再用接种针挑至含药平板中央，然后将培养皿倒置于培养箱(25℃)中培养。

4、于处理后不同时间观察测定菌丝的生长情况，并采用十字交叉法测得直径并处理数据，计算抑制率并拍照。

抑制率(％)＝(对照菌丝直径-处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100；

每个处理重复3次。

三、双氯芬酸钠对16种植物病原菌菌丝生长的抑菌效果

1.蓝莓拟茎点枝枯病菌：蓝莓拟茎点枝枯病是蓝莓上一种重要的枝干病害。寄主范围较广，主要有落叶松属、桃、梨属、越橘属、建始槭等植物。

2.蓝莓枝枯病菌：该病菌属于拟盘多毛孢属，是一种重要的植物病原菌，可寄生大约五十多科的植物，植物受害后表现为叶斑、腐烂、溃疡等症状，严重影响产品的产量和品质。因此，研究拟盘多毛孢菌对农林作物的生产具有重要的经济意义。目前，生产上的蓝莓主栽品种，如蓝丰、公爵和蓝美人等，均有枝枯病发生，显著影响其果实产量和品质。

3.花生黑斑病菌：花生黑斑病俗称“黑疸”、“黑涩”，为国内外花生产区最常见的叶部真菌病害，在花生整个生长季节皆可发生，但其发病高峰多出现于花生的生长中后期，故有“晚斑”病之称。常造成植株大量落叶，致荚果发育受阻，产量锐减。该病菌只侵害花生，迄今尚没有发现其他寄主。病菌主要以子座、菌丝和分生孢子在病残体上越冬，也可以子囊果在病残体内，或以分生孢子附着在种壳、种子上越冬，成为第2年发病的来源。在条件适宜时病菌菌丝直接产生的分生孢子随风雨传播。产生的病斑首先出现在靠近土表的老叶上，在收获前可造成几乎所有叶片脱落。

4.番茄早疫病菌：该病除直接危害茎、叶、果外，还可抑制番茄生长和果实形成，露地和保护地受害都较重，常年减产20％-30％，严重时可达50％以上，甚至绝产。此病原寄主范围广泛，除危害番茄外，还可危害茄子、辣椒和马铃薯等茄科蔬菜作物。

5.番茄灰霉病菌：番茄灰霉病是灰葡萄孢菌侵染所致的常见病害，是危害最大的病害之一，发生普遍。除危害番茄外，还可危害害茄子、辣椒、黄瓜、瓠瓜等20多种作物。低温、连续阴雨天气多的年份危害严重。发病严重时造成茎叶枯死和大量的烂花、烂果，直接影响产量。该病菌是一种寄主范围很广的兼性寄生菌，能侵染多种水果、蔬菜和花卉。

6.小麦赤霉病菌：赤霉病是一种毁灭性病害，可引起穗腐，造成严重减产和品质降低。随着全球气候变暖、耕作制度和方式的改变，小麦赤霉病不断蔓延扩展，常常造成小麦减产、品质降低，且受侵染的小麦籽粒中含有真菌毒素，可引起人畜中毒和严重疾病。该病菌除危害小麦外，还能侵染大麦、燕麦、水稻、玉米等多种禾本科作物以及鹅冠草等禾本科杂草，此外，还可侵染大豆、棉花、红薯等作物。

7.马铃薯枯萎病菌：尖孢镰刀菌是马铃薯枯萎病的主要致病菌，而且该菌是一种世界性分布的土传病原真菌，寄主范围十分广泛，可引起茄科、瓜类、香蕉、豆科、棉及花卉等多种植物枯萎病的发生。寄主被尖孢镰刀菌侵染后，症状表现多种多样，一般导致维管束褐变，植株萎蔫枯死，球茎和根腐烂，植株生长衰弱等。马铃薯枯萎病是近年来对马铃薯造成危害的一种重要的真菌性土传病害，在很多地区已有发生，尤其在马铃薯重荏地发生程度更为严重，直接影响了马铃薯产量及其经济效益。

8.烟草靶斑病菌：烟草靶斑病是由立枯丝核菌引起的叶斑类病害，该病菌主要危害叶片形成病斑，病斑坏死部分易碎形成穿孔，发生严重时病斑连片，并且病害流行速度较快，因此对烟草生产构成了严重威胁。该病菌的寄主范围广泛，不仅可以侵染烟草，在自然情况下可侵染200多种植物，包括玉米、高粱、棉花、麦类、水稻、大豆等粮食作物和甜菜、茄子、番茄、龙葵、尊麻以及矮牵牛等。此外，该病菌在人工接种条件下可侵染32科的188种植物。

9.棉花黄萎病菌：引起棉花黄萎病的病原菌是轮枝菌属的大丽轮枝菌。该病原菌的寄主范围极广，国外报道可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。我国经鉴定，寄主植物至少20科80种，大田作物包括棉花、向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等。该病菌能使寄主植物产生黄萎病，在世界范围内造成重大的经济损失。黄萎病防治困难，现有的防治手段如生物防治、化学防治、常规的遗传育种等都无法达到理想的防治效果。

10.玉米弯孢叶斑病菌：玉米弯孢叶斑病又称拟眼斑病、黑霉病，主要为害玉米叶片，有时也危害叶鞘和苞叶，在不同品种上其症状变化极大。该病菌寄主范围较广，可以寄生于番茄、辣椒的果实上，还可以寄生在水稻、高粱、小麦和一些草坪上，使得这些植物发生病害。玉米弯孢叶斑病是近年来我国华北、东北玉米产区普遍发生的一种病害，由于该病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，重病地块病株率及病叶率高达100％，已成为我国玉米产区的重要病害之一。

11.黄瓜棒孢叶斑病菌：该病菌寄主范围广泛，传播方式多样。近几年经调查发现，由黄瓜棒孢叶斑病菌引起的黄瓜、番茄等蔬菜的叶斑病在中国的山东、河北、辽宁、内蒙古等11个省市区大面积发生，造成了严重的经济损失。

12.苹果炭疽叶枯病菌：苹果炭疽叶枯病是由炭疽病菌引起的一种叶部病害，主要危害苹果的嘎拉、金冠、乔纳金、秦冠等品种，造成苹果树大量落叶和果实严重腐烂，树势严重削弱，导致次年绝产。富士、红星等品种高度抗病，发病的嘎拉和相邻未发病的富士苹果树在果园内对比非常明显。苹果炭疽菌叶枯病主要危害叶片，并导致大量落叶。

13.梨腐烂病菌：梨腐烂病又名烂皮病，主要危害梨树的主枝和侧枝，导致梨树势衰弱，果实产量和品质下降。该病具有发生区域广、发病率高、难以控制的特点。在我国梨主产区均有发生，尤以新疆、西北、华北、东北等地发生严重。发病严重的梨园，树体病疤累累、枝干残缺不全，造成大量死树或毁园。

14.苹果轮纹病菌：苹果轮纹病又名粗皮病、轮纹烂果病，是苹果枝干部和果实上的重要生物灾害，常引起苹果枝干树皮粗糙、局部性坏死和果实腐烂。患病植株坐果率低，导致树体衰弱和产量减少，甚至绝产毁园。近年来，随着易感品种富士苹果的大面积栽培，苹果轮纹病发病率逐年增加，危害面积不断扩大，已成为中国苹果生产中的严重病害，严重威胁着苹果产业的可持续发展。

15.蓝莓枝干溃疡病菌：引起蓝莓枝干溃疡病的病原菌-葡萄座腔菌属是一类世界性分布的真菌，所导致的树木溃疡病是世界范围内发生的重大病害。其危害的寄主很广，达45个属(阔叶树40个属、针叶树5个属)，对林果木危害严重，可引起桉树、杨树、苹果、石榴、桃树、草决明、杨梅、板栗等寄主植物的枝干溃疡枯萎死亡、干腐、流胶等症状。

16.苹果腐烂病菌：苹果树腐烂病是苹果树最主要、最严重的枝干病害。该病除了侵染枝干外还可以侵染果实，造成枯枝、死树，严重时造成毁园，从而造成严重的产量和经济损失。苹果树腐烂病菌拥有比较广泛的寄主植物，危害包括苹果、楼桃、桃和梨等在内的常见果树。

双氯芬酸钠对16种植物病原菌的离体抑菌作用检测结果见表1。

表1对16种病原菌菌丝生长的抑制作用测定结果(5d)

注：试验中每个处理设三次重复，表中数据为三次重复的平均值。

从表1中可知，随着双氯芬酸钠浓度的升高，其对16种植物病原菌的抑制效果也有不同程度的提高。当双氯芬酸钠浓度为1.0mm时，其中对蓝莓拟茎点枝枯病菌、番茄灰霉病菌、烟草靶斑病菌、梨腐烂病菌、蓝莓枝干溃疡病菌以及苹果腐烂病菌等的抑制率均在80％以上。当双氯芬酸钠浓度为1.5mm时，蓝莓拟茎点枝枯病菌、花生黑斑病菌、烟草靶斑病菌等9种植物病原菌的抑制率超过90％，可对其进行有效防治。

双氯芬酸钠对16种植物病原菌菌丝生长的抑菌效果图片如图1-16所示，当双氯芬酸钠在1.5mm时，蓝莓拟茎点枝枯病菌、花生黑斑病菌、烟草靶斑病菌、棉花黄萎病菌、黄瓜棒孢叶斑病菌、苹果炭疽叶枯病菌、苹果轮纹病菌、蓝莓枝干溃疡病菌和苹果腐烂病菌的菌丝基本没有生长。其他植物病原菌的菌丝生长较弱或较少，说明双氯芬酸钠起到了很好的抑制效果。综上所述，双氯芬酸钠很有潜力应用于植物病原菌的防治中。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。