一种水稻三交种的育种方法与流程

[0001]
本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻三交种的育种方法。


背景技术：

[0002]
杂种优势是指遗传组成不同的亲本经杂交所产生的f1植株在生活力、 生长势、抗逆性和丰产性等方面超过双亲的现象，杂交种(即f1)一般可 比亲本(自交系品种)增产20％～30％。目前，通过直接利用杂种优势，在 诸多作物上培育出了优良的杂交品种，并实现了大面积推广应用；如日本种 植的番茄、白菜、甘蓝杂交种品种的种植面积已达到了同类作物栽培面积的 90％以上，黄瓜为100％。美国种植的胡萝卜、洋葱、黄瓜杂交品种占85％ 左右，菠菜为100％。我国从50年代开始研究园艺植物的杂种优势利用，70 年代以来甘蓝、白菜、番茄、茄子、辣椒、黄瓜、西瓜和甜瓜等的杂交种品 种已大面积应用于生产；据不完全统计，已育成了20余种园艺植物的杂交 品种；并且，水稻、油菜、玉米、高粱、棉花等大宗农作物的杂交品种已大 面积推广。
[0003]
杂交种的优势强弱与集聚的优良基因数量有关。理论上，亲本数量越多， 则杂交种累积更多有利基因的概率就越高，其产量和适应性潜能就越强。目 前，一般的农作物主要以利用两个自交系品种杂交所产生的单交种(可表示 为a
×
b)为主(如水稻)，而“三交种”仅在玉米等少数作物上有一定的种植 面积。水稻是我国第一大粮食作物，也是杂种优势成功利用的作物之一；依 靠“三系法”和“两系法”技术实现了两个自交系品种之间的优势利用，这两种 技术体系都需要引入一个雄性不育系作为母本和一个恢复系作为父本，且要 求不育系的育性彻底败育，要求恢复系的恢复能力强、选择范围宽。
[0004]
三交种(f1’)是利用三个血缘不同的自交系先后经过两次杂交而形成的 杂交种；它可用(a
×
b)
×
c来表示，即以a和b杂交获得的单交fl做母本再 与c自交系配成杂交种。水稻属于雌雄同花植物，为了省去人工去雄便于制 种，“三交种”水稻的母本即a与b杂交所产生的f1需要为可遗传的“不育 系”；并且，为了确保“三交种”的育性正常，还要求c对f1具有恢复能力。 目前，水稻三交种育种主要采取“野败不育系/桥梁保持系∥恢复系”的方式 (袁利群等，杂交水稻，2003,18(6)：7-9)；在该系统中，野败不育系与 桥梁保持系杂交所产生的f1为细胞质与细胞核互作类型雄性不育，f1只能 被携带野败恢复基因的恢复系恢复育性产生三交种；由于恢保关系的严格制 约，只有5％左右的稻种资源携带恢复基因能作为野败不育系的恢复系使用， 导致该体系存在育种资源利用效率低和强优三交种的选育几率较低的问题。 目前，提升三交种育种效率的突破口在于建立新的f1雄性不育系统，拓宽 恢复系的选择范围。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻三交种的育种方法，利用本 发明方法得到的雄性不育f1代系双亲细胞核基因互作所控制，f1败育程度 彻底，且第三亲本(恢复系)的选择范围更宽；所述三交种的遗传组分更丰 富，具有显著提高水稻产量和适应性的
潜力。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种水稻三交种的育种方法，包括以下步骤：1)获得与 第一籼稻品种a同基本遗传背景的的tms5温敏不育系as；所述第一籼稻品 种的育性正常；
[0008]
2)以所述温敏不育系as为母本，以第二籼稻品种b为父本进行杂交， 得雄性不育f1代；所述第二籼稻品种b的育性正常；所述第一籼稻品种a 和第二籼稻品种b的杂交后代表现出杂种雄性不育；
[0009]
3)以所述雄性不育f1代为母本，以第三籼稻品种c为父本进行杂交， 得水稻三交种f1’。
[0010]
优选的，步骤2)所述杂交时的温度使所述温敏不育系as处于不育状 态。
[0011]
优选的，步骤3)得所述水稻三交种f1’后，还包括筛选。
[0012]
优选的，所述筛选的性状包括：结实率、生育期、株高、分蘖力、丰产 性和适应性。
[0013]
本发明提供了一种水稻三交种的育种方法，包括以下步骤：1)获得与 第一籼稻品种a同基本遗传背景的tms5温敏不育系as；所述第一籼稻品种 的育性正常；2)以所述温敏不育系as为母本，以第二籼稻品种b为父本 进行杂交，得雄性不育f1代；所述第二籼稻品种b的育性正常；所述第一 籼稻品种a和第二籼稻品种b的杂交后代表现出杂种雄性不育；3)以所述 雄性不育f1代为母本，以第三籼稻品种c为父本进行杂交，得水稻三交种 f1’。本发明所述育种方法，利用特异性籼稻品种不亲和的特性培育三交种， 所使用的籼籼交杂种比籼粳交杂种败育程度更彻底，且第三亲本的选择范围 更宽、恢复能力更强；所培育出的“三交种”比传统的“单交种”具有更丰 富的遗传组分，具有提高水稻产量和适应性潜力。
[0014]
生物保藏信息
[0015]
9814hs-1保藏于中国典型培养物保藏中心，具体地址为武汉市武昌珞 珈山，保藏编号为cctcc no:p201913；
[0016]
t98bs，分类命名oryza sativa l.t98bs，保藏于中国典型培养 物保藏中心，具体地址为武汉市武昌珞珈山，保藏时间为2019年08 月13日，保藏编号为cctcc no:p201914。
附图说明
[0017]
图1为本发明水稻三交种的育种流程图；
[0018]
图2为本发明验证籼籼杂交f1代雄性不育特性流程图；
[0019]
图3为t98b和m114b的籼粳属性分子标记分析，图中每个下划线表 示一组样品，每组样品次序为：日本晴，r9311，t98b，m114b；
[0020]
图4为t98b和m114b的籼粳属性杂交试验分析；
[0021]
图5为9814hs-1在三亚的育性表现，其中(a)为植株形态(3月3日)， (b)为花粉(2月14日)和小穗育性(3月11)；
[0022]
图6为本发明利用9814hs-2所配三交种结实率。
具体实施方式
[0023]
本发明提供了一种水稻三交种的育种方法，包括以下步骤：1)获得与 第一籼稻品种a同基本遗传背景的tms5温敏不育系as；所述第一籼稻品种 a的育性正常；
[0024]
2)以所述温敏不育系as为母本，以第二籼稻品种b为父本进行杂交， 得雄性不育f1代；所述第二籼稻品种b的育性正常；所述第一籼稻品种a 和第二籼稻品种b的杂交后代表现出杂种雄性不育；
[0025]
3)以所述雄性不育f1代为母本，以第三籼稻品种c为父本进行杂交， 得水稻三交种f1’。
[0026]
在本发明所述育种方法中，具体育种流程如图1所示：获得与第一籼稻 品种a同基本遗传背景的的tms5温敏不育系as；所述第一籼稻品种的育性 正常。本发明所述第一籼稻品种的基因型优选为x
aa
。本发明对tms5温敏不 育系as的获取方式没有特殊限定，利用本领域的常规方法获取即可，可以 是通过杂交转育tms5或基因编辑tms5。本发明所述温敏不育系as的遗传 背景与所述第一籼稻品种相同。本发明所述温敏不育系as在高温下表现出 不育性状。
[0027]
本发明以所述温敏不育系as为母本，以第二籼稻品种b为父本进行杂 交，得雄性不育f1代；所述第二籼稻品种b的育性正常；所述第一籼稻品 种a和第二籼稻品种b的杂交后代表现出杂种雄性不育。本发明所述第二 籼稻品种b的基因型优选为x
bb
，将所述第一籼稻品种与所述第二籼稻品种 进行杂交，其后代基因型为x
ab
，表现出雄性不育性状。本发明以所述温敏 不育系as为母本，以第二籼稻品种b为父本进行杂交，得雄性不育f1代， 所述杂交时的温度优选使所述温敏不育系as处于不育状态，即在高温环境 下进行杂交，优选高于28℃。本发明所述雄性不育f1代的基因型为x
ab
。
[0028]
本发明以所述雄性不育f1代为母本，以第三籼稻品种c为父本进行杂 交，得水稻三交种f1’。本发明所述第三籼稻品种的基因型为x
cc
，与雄性 不育f1代(基因型为x
ab
)进行杂交，其后代基因型为x
ac
或x
bc
，即为三 交种f1’。本发明在得所述水稻三交种f1’后，优选还包括筛选，所述筛选 的性状优选包括：结实率、生育期、株高、分蘖力、丰产性和适应性。本发 明所述水稻三交种f1’的结实性状正常。
[0029]
下面结合实施例对本发明提供的水稻三交种的育种方法进行详细的说 明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0030]
实施例1
[0031]
1.两个籼稻品种t98b和m114b的杂交f1(即9814hs-1)表现为条件型 雄性不育
[0032]
t98b是籼稻野败型细胞质不育系t98a(品种权号：cna20030224.8)的 保持系(邓小林，高异交率优质米不育系t98a选育简介，杂交水稻,2001, 16(4):14)。m114b是从自选材料mt2011b(系保持系炳1b的改造后代)与 珍汕97b杂交后选育而成的籼稻野败细胞质保持系。
[0033]
分别提取t98b、m114b及籼型对照品种r9311、粳型对照品种日本晴 (nipponbare)的叶片基因组dna。按照王林友等的方法(王林友等.利用 indel标记鉴定水稻育种材料的籼粳属性.核农学报,2013,27:913-921)，利 用19对籼粳特异性indel标记检测样品的基因型；将r9311(cna20000091.8) 和日本晴的扩增条带分别定义为“籼型”和“粳型”，将同时出现r9311和 日本晴的带型定义为籼粳杂合型；计算t98b和m114b样品的籼型和粳型基 因频率，以此确定它们的籼粳属性。19对籼粳特异性分子标记检测发现， t98b、m114b与籼稻r9311之间仅存在1对(r6m14)和0对有基因型差 异的indel标记，它们的籼稻基因频率达到了0.94和1.00(超过0.75为籼稻)； 与粳稻日本晴相比，t98b和m114b分别具有18对和19对
差异标记，其粳 稻基因频率仅为0.05和0.00(低于0.25为籼稻)，证明了t98b和m114b 都为籼稻属性(图3)。
[0034]
另一方面，选择代表性籼、粳材料与t98b、m114b配制杂交种，根据 杂交组合的结实率(反映“亲和性”的指标)来推断t98b和m114b的籼粳 属性。所选籼稻品种包括两系恢复系r9311(cna20000091.8)和五山丝苗 (cna006205e)，野败恢复系华占(cna20080059.0)和湘恢 299(cna20030123.3)，以及两系不育系株1s(cna20050416.9)、湘陵 628s(cna20070803.1)、y58s(cna20030431.3)和隆科638s(cna20090950.7) 等8份材料；粳稻品种包括日本晴、空育131(黑龙江认定编号：hr-2000-08)、 龙粳31号(cna20100737.4)和垦稻25号(cna20120184.0)等4份材料。2017 年12月至次年4月将各f1株系种植于海南三亚，各组合随机选取10个单 株的主穗调查其结实率；将结实率在67％～100％、34％～66％和0％～33％的组 合分别定义为“亲和”、“部分亲和”和“不亲和”三种类型，分析双亲与 测试亲本之间的亲和关系。杂交试验发现，t98b、m114b分别与8份籼稻 材料所配的16份杂交组合的结实率全部正常(80.35％～91.87％)，说明双 亲与籼稻材料皆为“亲和”关系；但是，t98b、m114b与4份粳稻品种的 杂交后代都表现为高度不育，结实率仅为2.57％～12.84％，表明它们与粳稻 不亲和(图4)。这一结果进一步证实了t98b和m114b都具有籼稻属性。
[0035]
尽管t98b与m114b是育性正常的保持系品种，但是，二者杂交后的 f1株系(命名为“9814hs-1”)在相对低温条件下表现为彻底的雄性不育 特性；该材料由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为cctcc no:p201913。以t98b和m114b为对照，于湖南长沙以及海南三亚观察 9814hs-1的育性情况；采用2.0％的i
2-ki的染色，将圆形、大小正常、可完 全染色的圆形花粉视为可染花粉，使用花粉可染率表示花粉育性；以套袋5 穗的平均结实率作为该株系的自交结实率。2017年9～10月，在长沙注意到 9814hs-1粉败育，但雌性正常(能接受r9311、湘恢299等品种的花粉而结 实)；9814hs-1在长沙9/10日始穗，花粉呈现半不育状态，可染花粉率为 49.43％，套袋结实率为22.24％；自9/25日至10/22日(此时气温逐渐降低)， 稻穗出现了不同程度的“卡颈”和败育，花药瘦小，i
2-ki镜检有典败和圆败 花粉粒，可染花粉率从4.26％迅速降低至0.00％，套袋自交率为0.00％。2018 年，9814hs-1在三亚于2/10日始穗，至3/17前彻底败育，可染花粉率几乎 为0.00％，完全不能结实(图5；表1)；自3/24日开始逐渐积累可染花粉 粒。相反，不论是长沙还是三亚，与9814hs-1同期抽穗的双亲t98b和m114b 的育性都处于正常水平，其花粉可染率达到了86.76％～96.87％，平均结实率 达到了78.97％～89.66％(表1)。
[0036]
表1 9814hs-1与双亲的育性差异
[0037]
[0038][0039]
*数值后跟相同字母者视无显著性差异
[0040]
2.利用温敏不育基因回交转育t98b获得与t98b同背景的t98bs
[0041]
2011～2016年，以携带温敏不育基因tms5的温敏不育系安农s-1为供体， t98b为轮回亲本进行杂交和连续回交(回交5次)，获得bc5f4世代的温 敏不育系t98bs。2016年，在长沙分别取t98bs、t98b和t98a三份材料 各10个稻穗调查农艺性状；结果发现，除育性差异外，t98bs的株型、穗 形、粒型与t98b、t98a相似，基本农艺性状一致(表2)。
[0042]
同年，委托华智水稻生物技术有限公司对t98bs、t98b进行56k芯 片检测，提取全部基因分型数据后，筛选出高质量snp位点比较二者之间 的遗传差异度。利用56k芯片共检出39，015个高质量snp位点，发现 t98bs与t98b共有相同标记为38，811个、差异标记为204个，遗传背 景回复率达到99.48％。
[0043]
表2 温敏核不育系t98bs的基本农艺特性观察
[0044][0045][0046]
千粒重为2016年三亚南繁数据。
a
1000 grain weight:data was collected in sanya,2014
[0047]
*数据后跟相同字母者表示在0.05水平无显著性差异
[0048]
3.t98bs与m114b杂交后产生雄性不育系“9814hs-2”[0049]
t98bs是高温不育、低温可育的温敏不育系，在长沙的夏季(6月下旬～ 9月上旬)具有安全败育期，可用来制备杂交种；当t98bs在不育条件下， 用其为母本与m114b进行制
种生产杂交种“9814hs-2”。9814hs-2表现为 与9814hs-1类似的条件型雄性不育性，即在2017年长沙10月上旬开始转 变为彻底的雄性不育，在2018年三亚的3月上旬以前花粉败育彻底(表3)。 根据自然观察结果，推测9814hs-2的育性转换临界温度约为27.5℃。
[0050]
表3 9814hs-2与双亲的育性差异
[0051][0052][0053]
4.利用9814hs-2生产三交种，三交种结实率正常
[0054]
将9814hs-2安排在三亚2月中上旬抽穗，可安全生产三交种。在三亚 试验基地，9814hs-2于2016年11月30日播种，2月25日前后始穗为彻底 败育(自交结实率为0.00％)；遂在此时段以9814hs-2为母本，以 r9311(cna20000091.8)、五山丝苗(cna006205e)、华占(cna20080059.0)、 湘恢299(cna20030123.3)及野败保持系天丰b(对应不育系天丰a品种 权号cna20030542.5)、丰源b(对应不育系丰源a品种权号cna20010186.2) 等代表性籼稻品种为父本分别配制杂交组合；2017年，随机取10个单株主 穗观察各组合的结实率，发现不论是低温环境(三亚2月中下旬抽穗)还是 高温环境(长沙8月中下旬抽穗)，9814hs-2与6个籼稻亲本所配制的杂 交组合(即“三交”组合)全都能正常结实，结实率达到了84.21～96.42％(图 6)，与生产上所推广的杂交稻结实率水平相当。
[0055]
本发明提供了一种水稻三交种的育种方法，利用特定籼稻品种间杂交后 代表现出雄性不育的特性进行育种，该f1雄性不育性由细胞核基因互作所 控制，具有安全败育
期，且第三亲本的选择性宽广，得到的三交种包含更丰 富的遗传组分，具有提高水稻产量和适应性潜力。
[0056]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。