一种提高水稻耐冷性的分子育种方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水稻遗传改良与生物技术应用领域，更具体地，本发明设及一种提高 水稻耐冷性的分子育种方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是重要的粮食作物，全世界约有半数W上的人口 W水稻作为主要粮食，在全 世界范围内均有种植。水稻是一种喜溫作物，它的生长发育对溫度非常敏感。水稻从种子发 芽到成熟的整个生长发育期间都存在低溫冷害。在芽期的冷害会导致延迟萌发W及萌发率 降低，阻碍成苗；在苗期，低溫会延迟秩苗生长甚至烂秩死苗，导致差的群体形成W及熟期 的不一致;在水稻生殖生长的敏感时期发生的冷害会使小抱子发育不良而减少花粉囊的花 粉粒从而引起不育导致产量损失。全世界有1500万hm 2W上的稻作面积受到低溫威胁，共有 24个国家存在严重的水稻冷害问题，尤W南朝鲜，日本，美国和中国最为严重。由于冷害对 水稻大范围的影响W及导致的严重产量损失，水稻的耐冷性在溫带的水稻种植区域W及南 亚和东南亚的高海拔地区显得非常重要。
[0003] 培育耐冷的水稻品种是减少冷害损失最有效的途径。然而，多年的育种实践证明 水稻耐冷性育种非常困难。由于水稻耐冷性是多基因控制的复杂性状，而且耐冷的表型鉴 定需要特定的低溫条件。因此，W表型鉴定为基础的传统育种方法由于无法准确了解水稻 耐冷性的遗传基础，从而难W对其进行准确的选择，水稻耐冷性育种进展缓慢。
[0004] 生物技术的发展，特别是分子标记技术的发展为深入了解如水稻耐冷性等复杂性 状的遗传基础和分子育种提供了有效的工具。应用分子标记技术进行水稻耐冷性遗传基础 研究方面已取得了很大的成绩。鉴定出的水稻发芽期耐冷WL有70个，芽期耐冷OTL有29个， 苗期耐冷WL有98个，孕穗至抽穗期耐冷WL有59个，分布在12条染色体上（杨梯丰等， 2015)。虽然定位了大量的耐冷QTL，但是却没有开展耐冷WL分子育种的报道。耐冷OTL分子 育种的困难在于Q化鉴定的不精确性，W及QTL间、Q化与环境存在互作。因此，对耐冷QTL的 精确鉴定和准确了解WL间、Q化与环境存在互作信息是水稻耐冷分子育种取得突破的关 键。
[0005] 单片段代换系为水稻耐冷QTL的分子遗传研究和分子育种提供了优良的材料。单 片段代换系是基因组内部只有一个纯合染色体片段来自供体亲本，其它部分与受体亲本相 同的品系。单片段代换系与受体亲本之间的差异W及在单片段代换系之间所有可遗传的变 异都只与代换片段上的基因（Q化)相联系巧IJ冠明等，2004)。用单片段代换系进行WL鉴定 消除了遗传背景的干扰，可W进行多重复、多点、多年的试验，提高QTL检测的准确性和可W 准确了解WL与环境互作的信息。利用有同一遗传背景，携带有不同优良WL的单片段代换 系进行聚合育种，排除了遗传背景对目标QTL的干扰，目标性状聚合准确，可W迅速获得稳 定的品系，大大减少了工作量(杨梯丰等，2010)。具有优良遗传背景的单片段代换系是设计 育种的好工具。由于简化了分子育种的程序，使育种变得易于操作，基于分子标记辅助选择 和优良单片段代换系的聚合育种能广泛应用于水稻数量性状育种。
【发明内容】
[0006] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种提高水稻耐冷性的分 子育种方法。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明采取了如下具体的技术方案：
[000引一种提高水稻耐冷性的育种方法，包括W下步骤：
[0009] (1 )、W耐冷性弱的水稻品系"华梗釉74"作为轮回亲本，耐冷性强的水稻品系"南 洋占"作为耐冷基因供体，构建W "华梗釉74"为遗传背景的单染色体片段代换系；
[0010] (2)、对步骤（1)构建的单染色体片段代换系进行多环境多重复的目标生长发育时 期的耐冷性检测，筛选出两份带有稳定耐冷WL的单染色体片段代换系Sl和S2(低溫冷处理 恢复后在多次实验中苗的存活率较轮回亲本显著提高的单染色体片段代换系）；标记PSMl 和PSM2与单染色体片段代换系Sl携带的耐冷QTL qCTS-6紧密连锁，标记RM17和PSM3与单染 色体片段代换系S2携带的耐冷QTL qCTS-12紧密连锁；
[0011] (3)、将步骤(2)筛选得到的带有稳定耐冷WL的单染色体片段代换系Sl和S2进行 杂交，利用耐冷QTL qCTS-6和qCTS-12紧密连锁的标记对聚合系的Fi、F2、的代群体进行跟踪 筛选有目标基因型的株系，在F2或的代得到纯合的耐冷OTL聚合系；
[0012] (4)、将步骤(3)中获得的聚合系进行目标生长发育时期的耐冷性评价，筛选得到 耐冷性显著提高的优良水稻品系。
[0013] 在其中一些实施例中，步骤(3)中所述耐冷WL的聚合系是通过SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4、沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6、W及SEQ ID N0:7和 SEQ ID N0:8所示的引物对辅助筛选获得的。
[0014] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述水稻轮回亲本为丰产性状好，品质优良的当 地主推品种。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述单染色体片段代换系是通过回交并结合全 基因组的分子标记辅助选择或低精度的全基因组测序技术构建得到的。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤(4)中所述耐冷性评价在人工气候箱、冷水灌概或自然 低溫条件下进行的。
[0017] 在其中一些实施例中，所述耐冷性评价是在日平均气溫为11.0°C的条件下进行 的。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有W下有益效果：
[0019] 1、传统水稻耐冷性育种中，耐冷表型的评价，需要在特定的低溫环境和特定的时 期进行;而本发明的提高水稻耐冷性的分子育种方法在精确鉴定出耐冷OTL的基础上，利用 与耐冷OTL紧密连锁的标记进行辅助选择，使得耐冷性的鉴定和选择简单、快速和经济；
[0020] 2、本发明的提高水稻耐冷性的分子育种方法W带有不同耐冷WL的一系列单染色 体片段代换系杂交，由于运些单染色体片段代换系W当地主推品种为背景，仅有1个或几个 供体染色体片段的差异，运样减少了对其它农艺性状的影响，可W迅速获得遗传背景优良、 耐冷性显著增强的优良品系；
[0021] 3、本发明的提高水稻耐冷性的分子育种方法通过分子标记辅助选择，从传统的对 特定时期的耐冷性表型鉴定和选择改进为对基因型的选择，基因型的选择可W在早期进 行，不受生育期的限制，因此，运种耐冷性育种新方法提高了育种的效率和准确性。
【附图说明】
[0022] 图1为实施例1中2个水稻品种苗期的耐冷性评价结果；其中**表示经t测验，在 0.01水平差异显著；
[0023] 图2为本发明实施例1中冷处理的溫度设定；
[0024] 图3为实施例1中耐冷的单片段代换系和华梗釉74的苗期耐冷性比较，其中*表示 经t测验，在0.05水平差异显著；
[0025] 图4为本发明实施例1中纯合耐冷WL聚合系的筛选结果，其中，WO:华梗釉74;S1: 携带耐冷QTL qCTS-6的单片段代换系;S2:携带耐冷QTL qCTS-12的单片段代换系；
[0026] 图5为本发明实施例1中耐冷QTL聚合系及其亲本的苗期耐冷性测验结果，其中：对 聚合系等4个品系进行DUCAN多重比较测验，其中带有相同字母的表示在0.05水平差异不显 著;带有不同字母的表示在0.05水平差异显著。
【具体实施方式】
[0027] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未 注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0028] 下面将结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0029] 实施例1 一种提高水稻耐冷性的育种方法
[0030] 该实施例为提高水稻品种"华梗釉74"的苗期耐冷性的育种方法，包括W下具体步 骤：
[0031] 1、品种耐冷性评价
[0032] 通过对26个水稻品种/品系苗期耐冷性的3次评价，发现广东省审定的釉稻品种 "华梗釉74"的苗期耐冷性较差，冷处理后平均存活率为26.63%，广西省的梗稻品种"南洋 占"的苗期耐冷性较强，冷处理后平均存活率为89.81 %，结果见图1所示。
[0033] 其中，苗期耐冷性评价方法为:每个品系挑选100粒饱满种子，在49.0°C高溫下处 理96h，W打破休眠。然后浸水36h，再置于30.0°C的恒溫箱内催芽4她，挑选发芽整齐的种 子，播种到35 . Ocm X 23. Ocm X 6. Ocm装满±的塑料盆里，设置3个重复，在