本发明属于胚胎学技术领域，涉及一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法。
背景技术：
胚胎冷冻保存就是将动物的早期胚胎，采用特殊的保护剂和降温措施进行冷冻，使其在-196℃的液氮中代谢停止或者减弱到足够小的程度，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能长期保存胚胎的一种生物技术。牛胚胎冷冻保存是由wilmut在1973年获得成功的。牛胚胎冷冻方法根据降温方法的不同，可以分为缓慢降温法和玻璃化冷冻法。缓慢降温法是指将用冷冻保护剂处理过的胚胎，利用由计算机控制降温速度的胚胎冷冻仪，首先从室温以-1.0℃/min的速度降温至植冰温度-7℃，保持10min，植冰后再以-0.3℃/min的速度降温至-30℃，然后直接投入液氨中长期保存。这种缓慢的降温方法可以防止细胞内结冰或减少冰晶的形成。植冰即诱发结晶，可以有效防止过冷现象对胚胎造成的危害。玻璃化冷冻法是将胚胎用冷冻保护剂处理后，直接投入液氮长期保存。其原理是高浓度的冷冻保护剂在冷却时粘滞性增加，当达到临界值时固化。
无论是缓慢降温法还是玻璃化冷冻法，都必须添加冷冻保护剂。冷冻保护剂可以与水结合，避兔或减少结冰的程度与速度，或仅结成较小的冰晶，同时冷冻保护剂可以降低冷冻过程中由于盐浓度升高而造成的溶质损伤。根据冷冻保护剂能否渗入细胞而将它们分为两类:--类是渗透性保护剂,这类化合物多为低分子化合物，能透过细胞膜，在高的分子浓度下快冻，尤其是慢冻时能保护细胞。这类保护剂主要包括甘油、二甲基亚枫、丙二醇、乙二醇、葡萄糖等；另一类是非渗透性保护剂，主要有蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。其作用的主要特点是在较快的冷冻及解冻速度中更有效的保护细胞。目前一般多采用联合使用两种以上冷冻保护剂组成冷冻保存液。但是，现有的冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好，导致细胞的冷冻存活率低。因此，需要对冷冻保存液进行改进，以提高细胞的冷冻存活率。
技术实现要素：
本发明提出一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液及冷冻方法，解决了现有技术中冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好，导致细胞的冷冻存活率低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液，所述冷冻保存液由以下重量份的组分组成：
hpes缓冲液40～50份，牛血清白蛋白0.1～0.5份，山梨糖醇2～5份，谷氨酰胺0.01～0.02份，聚乙烯亚胺10～15份，蔗糖20～25份。
作为进一步的技术方案，由以下重量份的组分组成：
hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，山梨糖醇3份，谷氨酰胺0.015份，聚乙烯亚胺12份，蔗糖23份。
作为进一步的技术方案，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000。
一种肉牛繁殖胚胎冷冻方法，包括下述步骤：将准备冷冻的牛胚胎先在预平衡液中平衡5～8min，再放入权利要求1～3任意一项所述的一种肉牛繁殖胚胎冷冻保存液中平衡30～40秒后转移至冷冻载体上，将冷冻载体投入液氮中进行冷冻。
作为进一步的技术方案，在将在预平衡液中平衡5～8min后的牛胚胎放入所述冷冻保存液中前，先将所述冷冻保存液预热至37～40℃。
作为进一步的技术方案，所述冷冻载体为ops。
作为进一步的技术方案，所述预平衡液有以下重量份的组分组成：
hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，谷氨酰胺0.03份，聚乙烯亚胺15份。
作为进一步的技术方案，所述牛胚胎为囊胚、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎或8-细胞胚胎。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明中，冷冻保存液及冷冻方法显著提高了胚胎的冷冻保存效果，使得冷冻胚胎解冻后的存活率大大提高，将牛胚胎的冷冻存活率提高到了90％以上，如：将牛囊胚的冷冻存活率提高到95.1％，将牛2-细胞胚胎的冷冻存活率提高到91.1％，将牛4-细胞胚胎的冷冻存活率提高到91.6％，将牛8-细胞胚胎的冷冻存活率提高到93.8％，有效的解决了现有技术中冷冻保存液对细胞的冷冻保存效果不好而使细胞的冷冻存活率低的问题。
2、本发明中，冷冻保存液由hpes缓冲液、牛血清白蛋白、山梨糖醇、谷氨酰胺、聚乙烯亚胺和蔗糖组成，各组分细胞毒性小，在冷冻过程中对细胞的损伤小，而且各组分相互配伍，显著提高了胚胎的冷冻存活率。小分子的山梨糖醇、谷氨酰胺可以渗透进入细胞内，在细胞内外产生一定的浓度，保护细胞免受高浓度电解质的损伤。在细胞冷冻和解冻过程中，谷氨酰胺还可以为细胞提供能量，从而进一步提高细胞冷冻存活率。选用高分子量的聚乙烯亚胺与蔗糖相互配合，可以优先于溶液中水分子结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成，同时，可以使溶液中电解质浓度降低，进一步保护细胞免受高浓度电解质的损伤，因此，大大提高了细胞的冷冻存活率，适合推广使用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
牛囊胚冷冻试验
1.液体配制：
预平衡液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，谷氨酰胺0.03份，聚乙烯亚胺15份，预平衡液的制备方法为在室温下将各组分搅拌混合均匀，得到预平衡液。
冷冻保存液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，山梨糖醇3份，谷氨酰胺0.015份，聚乙烯亚胺12份，蔗糖23份，冷冻保存液的制备方法为：在hpes缓冲液中先加入聚乙烯亚胺，溶解后加入牛血清白蛋白，在4℃静置溶解，再加入蔗糖、山梨糖醇和谷氨酰胺，在4℃静置溶解，得到冷冻保存液；使用前，先将冷冻保存液预热至38℃。
其中，聚乙烯亚胺的分子量为70000。
解冻液1：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖1mg/ml。
解冻液2：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml。
解冻液3：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml、牛血清白蛋白3mg/ml。
胚胎培养液：ksom培养液，市面上购得。
2、胚胎冷冻：将准备冷冻的牛囊胚先在预平衡液中平衡5min，再放入预热后的冷冻保存液中平衡30秒后转移至ops中，投入液氮中进行冷冻。
3、胚胎解冻：将解冻液1、解冻液2、解冻液3分别放在37℃培养箱中平衡15min后放在恒温台上，从液氮中取出ops，将含有胚胎部分直接浸入解冻液1中，平衡1min后将胚胎移入解冻液2中，平衡5min，再将胚胎移入解冻液3中，平衡5min，再将胚胎转入胚胎培养液，至于培养箱中继续培养，并于16h后观察结果。
按照上述方法将16批次生长状态良好的囊胚同时进行冷冻，每批次设置4～6个平行试验。观察保存结果。
同时设置常规冷冻保存液进行冷冻对照试验，冷冻和解冻流程与本发明相同，对照组使用的常规预平衡液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，乙二醇10份，蔗糖25份；对照组使用的常规冷冻保存液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，乙二醇18份，蔗糖23份。
4、试验结果：
试验冻存的16个批次的囊胚，存活率如表1所示：
表1本发明的冷冻液和常规冷冻液对牛囊胚的冻存效果
从表1中数据可以看出，本发明的冷冻保存液对牛囊胚的冷冻效果比常规冷冻保存液高，牛囊胚冷冻保存后的存活率高，而且性能更为稳定。
实施例2
牛2-细胞胚胎冷冻试验
1.液体配制：
预平衡液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，谷氨酰胺0.03份，聚乙烯亚胺15份，预平衡液的制备方法为在室温下将各组分搅拌混合均匀，得到预平衡液。
冷冻保存液：hpes缓冲液40份，牛血清白蛋白0.1份，山梨糖醇2份，谷氨酰胺0.01份，聚乙烯亚胺10份，蔗糖20份，冷冻保存液的制备方法为：在hpes缓冲液中先加入聚乙烯亚胺，溶解后加入牛血清白蛋白，在4℃静置溶解，再加入蔗糖、山梨糖醇和谷氨酰胺，在4℃静置溶解，得到冷冻保存液；使用前，先将冷冻保存液预热至37℃。
其中，聚乙烯亚胺的分子量为70000。
解冻液1：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖1mg/ml。
解冻液2：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml。
解冻液3：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml、牛血清白蛋白3mg/ml。
胚胎培养液：ksom培养液，市面上购得。
2、胚胎冷冻：将准备冷冻的牛2-细胞胚胎先在预平衡液中平衡5min，再放入预热后的冷冻保存液中平衡30秒后转移至ops中，投入液氮中进行冷冻。
3、胚胎解冻：将解冻液1、解冻液2、解冻液3分别放在37℃培养箱中平衡15min后放在恒温台上，从液氮中取出ops，将含有胚胎部分直接浸入解冻液1中，平衡1min后将胚胎移入解冻液2中，平衡5min，再将胚胎移入解冻液3中，平衡5min，再将胚胎转入胚胎培养液，至于培养箱中继续培养，并于16h后观察结果。
按照上述方法将15批次生长状态良好的2-细胞胚胎同时进行冷冻，每批次设置10～20个平行试验。观察保存结果。
同时设置常规冷冻保存液进行冷冻对照试验，冷冻和解冻流程与本发明相同，对照组使用的常规预平衡液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，乙二醇10份，蔗糖25份；对照组使用的常规冷冻保存液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，乙二醇18份，蔗糖23份。
4、试验结果：
试验冻存的15个批次的2-细胞胚胎，存活率如表2所示：
表2本发明的冷冻液和常规冷冻液对牛2-细胞胚胎的冻存效果
从表2中数据可以看出，本发明的冷冻保存液对牛2-细胞胚胎的冷冻效果比常规冷冻保存液高，牛2-细胞胚胎冷冻保存后的存活率高，而且性能更为稳定。
实施例3
牛4-细胞胚胎冷冻试验
1.液体配制：
预平衡液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，谷氨酰胺0.03份，聚乙烯亚胺15份，预平衡液的制备方法为在室温下将各组分搅拌混合均匀，得到预平衡液。
冷冻保存液：hpes缓冲液50份，牛血清白蛋白0.5份，山梨糖醇5份，谷氨酰胺0.02份，聚乙烯亚胺15份，蔗糖25份，冷冻保存液的制备方法为：在hpes缓冲液中先加入聚乙烯亚胺，溶解后加入牛血清白蛋白，在4℃静置溶解，再加入蔗糖、山梨糖醇和谷氨酰胺，在4℃静置溶解，得到冷冻保存液；使用前，先将冷冻保存液预热至40℃。
其中，聚乙烯亚胺的分子量为70000。
解冻液1：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖1mg/ml。
解冻液2：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml。
解冻液3：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml、牛血清白蛋白3mg/ml。
胚胎培养液：ksom培养液，市面上购得。
2、胚胎冷冻：将准备冷冻的牛4-细胞胚胎先在预平衡液中平衡5min，再放入预热后的冷冻保存液中平衡30秒后转移至ops中，投入液氮中进行冷冻。
3、胚胎解冻：将解冻液1、解冻液2、解冻液3分别放在37℃培养箱中平衡15min后放在恒温台上，从液氮中取出ops，将含有胚胎部分直接浸入解冻液1中，平衡1min后将胚胎移入解冻液2中，平衡5min，再将胚胎移入解冻液3中，平衡5min，再将胚胎转入胚胎培养液，至于培养箱中继续培养，并于16h后观察结果。
按照上述方法将15批次生长状态良好的4-细胞胚胎同时进行冷冻，每批次设置4～6个平行试验。观察保存结果。
同时设置常规冷冻保存液进行冷冻对照试验，冷冻和解冻流程与本发明相同，对照组使用的常规预平衡液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，乙二醇10份，蔗糖25份；对照组使用的常规冷冻保存液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，乙二醇18份，蔗糖23份。
4、试验结果：
试验冻存的15个批次的4-细胞胚胎，存活率如表3所示：
表3本发明的冷冻液和常规冷冻液对牛4-细胞胚胎的冻存效果
从表3中数据可以看出，本发明的冷冻保存液对牛4-细胞胚胎的冷冻效果比常规冷冻保存液高，而且性能更为稳定。
实施例4
牛8-细胞胚胎冷冻试验
1.液体配制：
预平衡液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，谷氨酰胺0.03份，聚乙烯亚胺15份，预平衡液的制备方法为在室温下将各组分搅拌混合均匀，得到预平衡液。
冷冻保存液：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，山梨糖醇3份，谷氨酰胺0.015份，聚乙烯亚胺12份，蔗糖23份，冷冻保存液的制备方法为：在hpes缓冲液中先加入聚乙烯亚胺，溶解后加入牛血清白蛋白，在4℃静置溶解，再加入蔗糖、山梨糖醇和谷氨酰胺，在4℃静置溶解，得到冷冻保存液；使用前，先将冷冻保存液预热至37.5℃。
解冻液1：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖1mg/ml。
解冻液2：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml。
解冻液3：以hpes缓冲液为基础溶液添加蔗糖2mg/ml、牛血清白蛋白3mg/ml。
胚胎培养液：ksom培养液，市面上购得。
2、胚胎冷冻：将准备冷冻的牛8-细胞胚胎先在预平衡液中平衡5min，再放入预热后的冷冻保存液中平衡30秒后转移至ops中，投入液氮中进行冷冻。
3、胚胎解冻：将解冻液1、解冻液2、解冻液3分别放在37℃培养箱中平衡15min后放在恒温台上，从液氮中取出ops，将含有胚胎部分直接浸入解冻液1中，平衡1min后将胚胎移入解冻液2中，平衡5min，再将胚胎移入解冻液3中，平衡5min，再将胚胎转入胚胎培养液，至于培养箱中继续培养，并于16h后观察结果。
按照上述方法将15批次生长状态良好的8-细胞胚胎同时进行冷冻，每批次设置10～20个平行试验。观察保存结果。
同时设置常规冷冻保存液进行冷冻对照试验，冷冻和解冻流程与本发明相同，对照组使用的常规预平衡液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.4份，乙二醇10份，蔗糖25份；对照组使用的常规冷冻保存液的配方为：hpes缓冲液45份，牛血清白蛋白0.3份，乙二醇18份，蔗糖23份。
4、试验结果：
试验冻存的15个批次的8-细胞胚胎，存活率如表1所示：
表4本发明的冷冻液和常规冷冻液对牛8-细胞胚胎的冻存效果
从表4中数据可以看出，本发明的冷冻保存液对牛8-细胞胚胎的冷冻效果比常规冷冻保存液高，而且性能更为稳定。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。