一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用与流程

本发明属于动物发病模型建立领域，具体涉及一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法及其应用，尤其是在疫苗或抗感染药物筛选过程中的应用。

背景技术：

塞内卡病毒(senecavirusa，sva)是一种主要感染猪的病毒，属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属。该病毒主要通过接触传播，可以引起猪的鼻吻、蹄部冠状带水疱病变，与口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病在临床症状上极其相似，难以区分。该病毒对成年猪表现为亚临床感染、繁殖，猪在蹄冠和鼻部产生病变，或呈现隐性感染，这使得上市猪存在巨大风险，并且能够引起7日龄内新生仔猪死亡率高达30％～70％。我国对该病研究较晚，目前市场上还没有预防和控制该病毒的安全、高效的疫苗，都处于研发阶段。研发阶段动物实验尤为关键，然而，目前由于非洲猪瘟等猪传染病的影响，实验猪的采购十分困难且不再安全可靠，大大的制约了实验进度和疫苗或抗感染药物的开发。因此，构建sva相关动物模型对疫苗或抗感染药物的开发至关重要，同时可以大大节省研发费用。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法，包括对家兔接种塞内卡病毒液，其中所述塞内卡病毒液的接种毒量不低于10^8.5tcid50。

上述塞内卡病毒液的毒价不低于10^7.5tcid50/0.1ml，接种量为≥1.0ml/只。

上述塞内卡病毒液为svv/ch/zz/2016cgmccno.14886的病毒液。

上述接种采用滴鼻的方式进行接种。

上述家兔的体重为2～3公斤。

上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法还包括确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功的步骤，具体为：接种后观察家兔唇部，若出现白色粉刺样的凸起，则确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功。

上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法还包括确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功的步骤，具体为：采集所述白色粉刺样的凸起，以及收集所述塞内卡病毒液分别进行提取rna，并进行pcr检测，若扩增出目的条带，并且所述白色粉刺样的凸起的扩增目的条带与所述塞内卡病毒液的扩增目的条带一致，则确定所述塞内卡病毒家兔动物模型建立成功。

上述pcr检测的引物为序列表中seqidno:1和seqidno:2所示，目的条带的大小为129bp。

本发明另一方面还提供一种塞内卡病毒家兔动物模型，其由上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法获得，接种塞内卡病毒后的家兔唇部有白色粉刺样的凸起。

上述的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法或上述的塞内卡病毒家兔动物模型在筛选塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物中的应用也属于本发明的内容。

基于以上技术方案提供的塞内卡病毒家兔动物模型的建立方法可以有效使用家兔代替实验猪建立塞内卡病毒动物模型，从源头消除非洲猪瘟等猪传染病带来的影响；同时本发明提供的动物模型建立方法采用家兔作为实验动物，相对于实验猪，家兔在饲养成本上相对较低，购买成本也相对较低，可以有效缩减成本。并且本发明建立的sva家兔动物模型与以猪为实验动物的sva模型的临床症状高度相似，在建立的sva家兔动物模型中，粉刺样凸起是由塞内卡病毒引起的家兔发病症状，因此家兔能作为塞内卡病毒疫苗、药物研发的实验动物，应用中该模型还能够避免sva的感染症状与口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病症状的混淆，将猪sva感染与猪口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等疾病区别开来。sva家兔动物模型的建立方法操作简便，将为新型塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物的开发提供优化的评价方案和指标，具有十分重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为粉刺样凸起的pcr检测结果；

图2为粉刺样凸起的形态照片。

具体实施方式

本发明旨在建立一种塞内卡病毒家兔动物模型，以代替以猪为实验动物的模型，为新型塞内卡病毒疫苗或抗塞内卡病毒药物的开发提供评价方案和指标。

通过以下具体实施方式详细说明本发明。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。

实施例1：塞内卡病毒液的制备

该实施例选择使用svv/ch/zz/2016cgmccno.14886(cn110551694a)作为种毒制备塞内卡病毒液，包括以下步骤：

(1)将塞内卡病毒种毒接种于长满单层的pk-15细胞(猪肾细胞，金宇保灵生物药品有限公司提供)，置37℃的co2培养箱中培养5日，反复冻融3次收获病毒培养液，记为f1代，置-20℃保存。取收获的病毒培养液f1代，按照10％(v/v)的含量接种已长满单层的pk-15细胞，置于37℃的co2培养箱中培养，每日观察细胞病变(cpe)，接种后48小时收获病毒培养液液，记为f2代。继续按上述方法传代，传至出现典型病变(表现为细胞圆缩、聚合、出现空洞，甚至脱落)为止，该实施例中培养至f3代即出现典型病变。继续传代至f7代，为病变最典型的最低代次，收获病毒液，测定毒价为10^7.5tcid50/0.1ml。该过程由金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室完成。

(2)对收获的病毒液进行rna提取(采用rna提取试剂盒，生工生物工程有限公司)：取200μl病毒液加入1.5ml离心管中，加入200μlbufferv-l，涡旋振荡混合均匀，静置5分钟；加入75μlbufferv-n，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5分钟；将上清转移至新的2ml离心管中，加300μl异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6～8次，混合均匀，将其移入制备管，置于2ml离心管中，6000rpm/min离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加500μlbufferw1a，置温室静置1分钟，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，加800μlbufferw2，12000rpm离心1分钟；弃去滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000rpm离心1分钟；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加40μl无酶水，室温静置1分钟，12000g离心1分钟洗脱rna，-20℃冻存备用。

(3)pcr检测收获的病毒液：将上述步骤(2)中提取的病毒液rna，使用pcr方法鉴定sva，方法如下：上游引物sva-f：5’-tatctcagatccctggctgtc-3’(seqidno:1)；下游引物sva-r：5’-cctgatgatcacattgttgagc-3’(seqidno:2)。反应体系：2×onesteprt-pcrbufferⅲ12.5μl，takaraextaqhs0.5μl，primescriptrtenzymemixⅱ0.5μl，sva-f(20μm)0.5μl，sva-r(20μm)0.5μl，rna模板2.0μl，rna-freeh2o5.8μl。pcr反应条件为：首先42℃反转录15分钟，95℃2分钟预变性；然后94℃变性10秒，59℃退火30秒，45个循环(pcr扩增)。将pcr扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察结果，在129bp附近出现明亮单一条带，与pcr引物的扩增目的片段大小一致，确认该病毒液为塞内卡病毒液。

实施例2：塞内卡病毒家兔动物模型的建立及鉴定

该实施例中选择使用上述实施例1获得的塞内卡病毒液对家兔进行接种，具体包括以下步骤：

(1)实验动物选取：选取体重为2～3公斤的家兔(购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司)28只，雌雄不限，sva血清中和抗体小于1:2。其中实验组家兔24只，对照组家兔4只。

(2)对上述实施例1获得的塞内卡病毒液用细胞维持液(含1.5％(质量百分比)nahco3的mem培养基)分别稀释为10^6.5tcid50/0.1ml、10^5.5tcid50/0.1ml、10^4.5tcid50/0.1ml、10^3.5tcid50/0.1ml、10^2.5tcid50/0.1ml。

(3)按下表1所示的接种方法，分别对实验组家兔和对照组家兔进行接种，其中接种途径为滴鼻，接种量均为1ml/只。

表1：sva病毒接种方法

(4)观察各组家兔唇部变化：接种后仔细观察各组家兔唇部，发现接种sva病毒液5～8天后，接种毒量为10^3.5tcid50(即接种毒价为10^2.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔0/5发病；接种毒量为10^4.5tcid50(即接种毒价为10^3.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔0/5发病；接种毒量为10^5.5tcid50(即接种毒价为10^4.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔1/5唇部出现粉刺样凸起，如图2中(a)和(b)幅所示；接种毒量为10^6.5tcid50(即接种毒价为10^5.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔2/5唇部出现粉刺样凸起；接种毒量为10^7.5tcid50(即接种毒价为10^6.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔3/5唇部出现粉刺样凸起；接种毒量为10^8.5tcid50(即接种毒价为10^7.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)的家兔5/5唇部出现粉刺样凸起。对照组家兔唇部未出现异常。经确认(以下详述)，该粉刺样凸起是由塞内卡病毒引起的发病症状，因此可以确认当接种的塞内卡病毒液的毒量不低于10^8.5tcid50时，可以保证塞内卡病毒家兔动物模型建立成功，接种病毒液的家兔的唇部全部出现粉刺样凸起。

(5)采集粉刺样凸起部位，进行分离及检测鉴定：采用无菌的眼科镊子，将白色凸起部位取下，装入盛有pbs液的无菌小管中，保持低温状态送回实验室。利用组织分散仪将其打碎，制成组织悬液，置于-70℃冰箱反复冻融2次，3500rpm/min离心10分钟，取上清，作为待检样品备用。随后按照上述实施例1中步骤(2)和步骤(3)的方法对该待检样品进行rna提取和pcr检测，检测结果如图1所示，其中m表示marker，f泳道表示待检样品，n泳道表示阴性对照，p泳道表示阳性对照，可见在129bp附近出现明亮单一条带，与pcr引物的扩增目的片段大小一致，并与塞内卡病毒的病毒液的pcr检测结果一致，证明该待检样品中含有塞内卡病毒，即粉刺样凸起是由塞内卡病毒引起的发病症状，确认唇部出现粉刺样凸起的塞内卡病毒家兔动物模型建立成功，并最终确定以塞内卡病毒接种毒量为10^8.5tcid50(即接种毒价为10^7.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)接种家兔的方法建立塞内卡病毒家兔动物模型。

实施例3：塞内卡病毒家兔动物模型临床症状

该实施例中选择10^8.5tcid50(即接种毒价为10^7.5tcid50/0.1ml的病毒液1ml)为接种剂量对家兔进行接种，并观察家兔的临床症状，具体包括以下步骤：

(1)实验动物选取：选取体重为2～3公斤的家兔(购自鄂尔多斯市达拉特旗永恒农牧业开发有限公司)8只，雌雄不限，sva血清中和抗体小于1:2。其中实验组家兔4只，对照组家兔4只。

(2)取上述实施例2使用的塞内卡病毒液(毒价为10^7.5tcid50/0.1ml)对实验组家兔进行接种，接种途径为滴鼻，接种量为1ml/只(接种剂量为10^8.5tcid50)。另取细胞维持液(含1.5％(质量百分比)nahco3的mem培养基)对对照组家兔进行接种，接种途径为滴鼻，接种量均为1ml/只。

(3)临床症状观察：接种后仔细观察实验组与对照组家兔唇部少毛或无毛处临床症状变化，发现攻毒后第5天实验组家兔鼻唇部开始出现多处不同程度红肿，第6～7天红肿部位逐渐凸起，形成粉刺样病变，攻毒后第8天实验组家兔全部发病，发病家兔鼻唇部多处出现粉刺样凸起；对照组家兔未发现类似症状。

在以往以猪为实验动物的塞内卡病毒模型中，当实验猪感染塞内卡病毒后，以鼻盘、口唇部出现水泡样损伤为临床症状特征，该实施例以家兔为实验动物建立塞内卡病毒发病模型，临床表现为粉刺样凸起，均是由塞内卡病毒引起的发病症状，因此与实验猪感染塞内卡病毒的典型症状高度相似。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。