一种通过高脂饮食联合STZ诱导建立SD大鼠2型糖尿病研究模型的方法与流程

本发明属于医学领域，尤其涉及一种通过高脂饮食和stz诱导建立的sd大鼠2型糖尿病模型方法。

背景技术：

糖尿病已成为全世界范围内严重的公众健康问题，目前全球约有4.25亿成人患有糖尿病，2型糖尿病占糖尿病总数的90％-95％，它庞大的患病人数还导致了巨大的医疗支出。因此，建立一种类似临床2型糖尿病的动物模型，对医学临床研究具有重要的意义。建立糖尿病的模型有很多种，目前的研究表明，sd大鼠作为实验动物，与人类具有相似的糖尿病病理特征。在2型糖尿病的发病机制中，两个关键因素是胰岛素敏感性降低和胰岛b细胞功能障碍。有证据表明高脂饮食是导致胰岛素抵抗的独立危险因素之一，而胰岛素抵抗被认为是代谢综合征、高血压、肥胖和糖尿病的“共同土壤”。stz是从无色链霉菌中提取的一种抗生素，本质上是一种氨基葡萄糖-亚硝基脲，由于它具有胰岛β细胞毒性被用于1型和2型糖尿病动物模型制备。胰岛b细胞功能障碍的严重程度取决于stz的注射剂量及方式，使用高剂量stz能够破坏全部胰岛功能诱导1型糖尿病，而低剂量导致的少部分胰岛b细胞破坏被用于诱导2型糖尿病。中国专利申请cn109221011a公开了一种建造高脂饮食和低剂量注射stz诱导的糖尿病和肥胖sd大鼠模型的方法，其采用脂肪供能比60％的高脂饮食8周联合腹腔多次小剂量stz构建模型。一般来说30-50％为高脂饮食，而大于50％被认为是极高脂肪饮食，脂肪含量较高的饲料一般不宜成型及储存，因此工艺要求较高，相对价格更贵。腹腔注射stz相比尾静脉所需药量更多，若stz经腹腔误打入脏器，容易造模失败，甚至引起大鼠死亡。

技术实现要素：

为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种建造高脂饮食联合低剂量尾静脉注射stz诱导的sd大鼠2型糖尿病模型方法，来模拟人类不良饮食和环境造成的胰岛素敏感性降低和胰岛b细胞功能障碍。

本发明提供了一种通过高脂饮食联合stz诱导建立sd大鼠2型糖尿病研究模型的方法，包括以下步骤：

步骤1，选取spf级sd大鼠4周龄，雄性，体重为80-100g,使用普通饲料适应性喂养1周后，将大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组；其中正常对照组给予普通饲料喂养，糖尿病组给予高脂饲料喂养。

步骤2，每日按大鼠体重的10％给予饲料喂养，恒定温度和湿度环境下自由进食饮水；

步骤3，观察步骤2中大鼠一般状态和体重变化，高脂喂养12周后进行口服葡萄糖耐量试验、腹腔胰岛素耐量试验，判断是否存在胰岛素抵抗；

步骤4，将糖尿病组大鼠禁食10--12h,按照stz总剂量为25mg/kg进行尾静脉注射，正常对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。stz注射1周后，尾静脉检测大鼠随机血糖，血糖≥16.7mmol/l判断造模成功。

本发明的效果：本发明选择sd大鼠作为实验动物，采用12周高脂饮食诱导胰岛素抵抗和腹腔注射低剂量stz建立模型，本模型具有超重、糖耐量减低、胰岛素敏感性下降特点，可以更好地模拟人类因不良饮食习惯(高糖高脂饮食)引起的2型糖尿病模型，高脂饮食增加了大鼠胰岛素抵抗，小剂量stz能够破坏胰岛b细胞部分功能，使胰岛素分泌减少，造成外周组织对胰岛素不敏感，形成非胰岛素依赖型糖尿病，即2型糖尿病。胰岛b细胞功能障碍的严重程度取决于stz的注射剂量，使用高剂量stz破坏全部胰岛功能诱导1型糖尿病，而使用低剂量stz导致的胰岛b细胞分泌紊乱被用于诱导2型糖尿病。stz的注射方式、剂量一直未有定论。本发明采用小剂量stz尾静脉注射的方法，既可以避免大剂量注射胰岛b细胞功能全破坏导致的糖尿病高渗状态和酮症酸中毒，又可以避免stz误打入腹腔脏器造成模型失败或死亡。

优选的，步骤1中的普通饲料组分为：小麦10份，麸子30份，玉米面30份，豆饼20份，鱼粉5份，骨粉2份，酵母2份和食盐1份。

优选的，步骤2中的高脂饲料组分为：小麦10份，麸子30份，玉米面30份，豆饼20份，鱼粉5份，骨粉2份，酵母2份，食盐1份，猪油5份、酥油5份、蔗糖10份、胆固醇2.5份、胆酸钠1份。

优选的，高脂喂养12周，行糖耐量、胰岛素耐量试验，建立胰岛素抵抗模型后给予小剂量stz尾静脉注射。

优选的，糖尿病模型成模标准：(1)stz注射前存在胰岛素抵抗；(2)stz注射1周后，随机血糖≥16.7mmol/l。

优选的，步骤2中，恒定温度和湿度环境指的是温度22±2℃,湿度65-75％。

优选的，电磁铁的宽度等于调速段的长度；如此设置能够保证工作时，电磁铁能够充分与调速段进行配合作用。

本发明的有益效果：本发明的实验对象选择sd大鼠，种属纯正，是进行代谢病相关实验的理想动物材料，模型取材易得。使用发明采用高脂饲料喂养12周，诱导胰岛素抵抗模型，以及12周后stz小剂量尾静脉注射诱导糖尿病动物模型的建立，该方法可以更好地模拟现如今由于饮食不当和环境因素造成的人类2型糖尿病发病特点。与其他造模相比，本发明在高脂饲料中添加了藏区特有的酥油，酥油是似黄油的一种乳制品，是从牛、羊奶中提炼出的脂肪，藏区人民最喜食牦牛产的酥油。产于夏、秋两季的牦牛酥油，色泽鲜黄，味道香甜，口感极佳，冬季的则呈淡黄色。将其添加入高脂饲料中，饲料味道更香，大鼠食欲更佳，利于提高大鼠摄食量，造成大鼠超重肥胖。在高原地区造模(西宁海拔)，高原地区由于空气氧含量低于平原，糖的有氧代谢受阻，无氧酵解增强，在低氧的初期，血糖升高，1-2天时开始下降，所以大鼠需要一个适应期。且采用尾静脉注射小剂量stz造模，大鼠全部成模。

附图说明

图1为各组大鼠形态比较图；ng:正常对照组，dm:糖尿病组。

图2为各组大鼠口服糖耐量试验、胰岛素耐量试验。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明中，实验动物选择spf级sd大鼠spf级雄性spraguedawley(sd)大鼠30只，4周龄，体质量80～100g，购于西安交通大学医学部实验动物中心，动物合格证号：61001700003722，许可证号scxk(陕)2017-003。2只每笼喂养，室温22±2℃，相对湿度65-75％，每天12小时光照，12小时黑暗循环，自由饮水、摄食。

本发明实验周期为13周。适应性喂养72h后将大鼠随机分为正常对照组(ng):10只/组，为了增加大鼠的食欲，本发明的高脂饲料中增加了酥油，且从实验数据中可得知，与ng组相比，dm组大鼠的体重显著增加，具有统计学意义，所有大鼠均成模，不存在实验失败导致样本脱落的现象。

stz(美国sigma公司)；柠檬酸钠缓无菌缓冲液，购自北京solarbio公司；门冬胰岛素注射液(诺和锐)、50％葡萄糖溶液，均购自青海省人民医院；卓越金采血糖仪及试纸(美国罗氏公司)等。

本发明通过下述实施例进一步详细描述通过高脂饮食联合stz诱导建立的sd大鼠2型糖尿病模型：

步骤1，将大鼠随机分为正常对照组(ng):10只/组，给予对照饲料喂养；肥胖组(ob)和糖尿病组(dm):20只/组，给予高脂饲料喂养。

步骤2，高脂饲养12周，每2只一笼，恒定温度和湿度环境下自由进食饮水，白夜周期12h饲养。

步骤3，观察步骤(2)中大鼠的一般指标变化，每周记录摄食、饮水、体重，并观察精神状态、垫料潮湿度、毛发光亮度、活动、眼睛等。(4)高脂饮食喂养第12周，进行ogtt、ipitt试验，检测大鼠的糖耐量及胰岛素敏感性。在ogtt试验中，大鼠禁食12h后，灌胃给予20％的葡萄糖溶液2g/kg，尾静脉检测0min及葡萄糖灌胃后30、60、90、120min的血糖。间隔48h后，进行ipitt试验，大鼠禁食6h，于腹腔注射0.5u/kg的门冬胰岛素溶液，尾静脉检测0min及注射后15min、30min、60min、90min、120min的血糖。高脂喂养第12周末，大鼠禁食10-12h，dm组尾静脉注射2％stz液25mg/kg，ng组给予相同剂量的杅檬酸钠缓冲液。

步骤4，stz注射1周造模稳定后，血糖仪检测大鼠随机血糖，以血糖升高(随机血糖≥16.7mmol/l)为成模标准。

结果分析：

(1)一般情况

如图1所示，ng组大鼠(图片右侧的大鼠)精神状况良好，反应灵敏，动作自如，双目有神，毛发平伏有光泽。dm组大鼠(图片左侧的大鼠)精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，倦怠懒动，弓背倦体，垫料潮湿，进食量、饮水量显著增加；

(2)体重变化

统计分析：

采用spss25.0和prism7图像分析统计软件进行统计分析。计量资料以表示，两组间两两比较用独立样本t检验，检验水平α＝0.05。

stz干预前，两组大鼠体质量随周龄增加而增加，dm组体重增幅略高于ng组，但差异无统计学意义，在12周末dm组显著高于ng组(p＜0.05)，见图2a。stz干预后dm组体重呈下降趋势,差异显著(p＜0.05)，但从第6周开始，下降幅度逐渐减小；而ng组体重随着周龄仍然逐渐增加，但增幅较之前有所下降，见图2b。

ogtt试验表明，在给予葡萄糖负荷后，ng组30min后血糖升至最高，而dm组血糖高峰延迟至60min，且葡萄糖清除率总体上出现延迟，在60、90、120min血糖明显高于ng组(p＜0.05)，见图2c。相应的，ipitt试验表明，注射胰岛素两组大鼠血糖在15min及30min快速下降，于60min后血糖达到最低点，但dm组血糖总体仍高于ng组(p＜0.05)，见图2d，提示dm组大鼠的胰岛素敏感性下降。这些结果都反应了dm大鼠存在胰岛素抵抗。

两组大鼠在stz干预前随机血糖差异无统计学意义(p＞0.05)。stz干预后1-8周，dm组血糖明显高于ng组(p＜0.05)，并于stz注射3周末逐渐趋于稳定，见图2e。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。