专利名称：采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法
技术领域：
本发明涉及一种动物模型的构建方法，具体地说，是采用放射性内照射建立甲状腺功能减低WiStar大鼠眼眶模型的方法，用于观察眼眶受体分布和表达。
背景技术：
临床上进行131I治疗⑶甲亢过程中如发生甲减，极有可能存在TAO恶化的危险性，部分患者可能诱发Graves眼病(GO)的发生，其发病机制尚不十分清楚，预防和治疗都比较棘手，目前尚无比较合适的动物模型用以观察这类眼眶组织的病理改变。长期以来一直寻找131I治疗⑶后甲减诱发GO的原因，并通过动物模型观察眼眶组织学变化了解其发病机制，目前已有多种方法制作了甲亢或甲减及其相关眼病的动物模·型。一、首先实验动物的选择上，主要是大鼠，因大鼠的甲状腺功能以及下丘脑-垂体-甲状腺轴与人类基本相似，且其价格低廉、分布广、繁殖快、体积小、易于饲养管理。二、常用甲减模型
I、低碘甲减模型房辉等制作动物模型的方法为WiStar鼠食用重度缺碘地区粮食配制的饲料加去离子水，3月后即可成模。2、化学诱导甲减模型已成功证实以下化学物质能诱发甲减丙基硫氧嘧啶(PTU) /碘番酸(Ι0Ρ)、PTU、甲基硫氧嘧啶(MTU)、他巴唑(MZ)、甲状腺激素(TH)、1311、过氯酸钠(NaClO4)。Rebagliati等取240 280g Wistar雄鼠，腹腔注射m I I月，造模成功。m I法是通过131 I物理作用，其机理主要为发射β射线杀伤甲状腺细胞，使甲状腺素(TH)分泌减少。3、先天性甲减模型既可以用低碘饲料，也可以用化学诱导剂来诱发，不同的是所选动物为怀孕雌鼠。4、转基因甲减模型。5、甲状腺切除甲减模型甲状腺切除甲减模型是经典的甲减模型，切除绝大部分甲状腺必定造成甲减。以上甲减模型用于甲亢经131 I仍不理想，没有良好地模拟疾病发展的自然状态。同时由于甲减病因复杂，目前的甲减动物模型还没有囊括所有病因的甲减，大多限于原发性甲减和TH抵抗综合症的研究，对于继发性甲减和TSH抵抗综合症则研究甚少。三、方法对比总结。低碘甲减模型(包括低碘先天性甲低模型)存在耗时、耗费等缺点。化学诱导甲减模型(包括化学诱导甲减模型)存在耗时、耗资、不能较好模拟自然病程等缺点。转基因甲减模型存在操作过程复杂、技术性强、成功率低等缺点。
虽然切除甲减模型简单易操作、造模成功率高可达100 %，但不是甲亢治疗后的自然甲减。以上的模型均与实际的甲亢经内照射致甲减的眼病比较，其诱因和发展过程有较大区别。另外，各模型间造模成功的标准也不同。应该根据研究目的不同，制造不同的甲减动物模型。同时具备耗时耗费少、操作简单、成功率高、模拟疾病发展的自然状态的条件是才是理想的甲减动物模型。目前直接采用内照射甲亢动物的方法致甲减的眼眶模型，国内外尚未查到文献报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法，所述的方法包括以下步骤a、通过放射性131 I内照射Wi star大鼠；b、使用人类促甲状腺激素腹腔注射Wi star大鼠。 所述的步骤a中通过放射性131 I内照射Wistar大鼠的方法是腹腔注射131I碘化钠。所述的131I碘化钠的腹腔注射剂量为300 μ Ci或500 μ Cl/每只。所述的人类促甲状腺激素腹腔注射的时间是第6周。所述的方法包括以下步骤a、腹腔注射131I碘化钠注射液，注射剂量为300 μ ci或500 μ ci/每只；b、第6周，人类促甲状腺激素用O. 9%生理盐水稀释到83. 2 μ g/mL，大鼠腹腔注射，注射剂量为100 μ L/每只；C、用于观察眼眶生长抑素受体的分布。本发明优点在于
1、该动物模型制作简单，费用低，易重复；
2、成功率高，85%发生甲减，甲状腺组织且有甲减的普遍特征；
3、其中100%有甲状腺相关眼病的特征；
4、发现眼眶生长抑素受体分布异常；
5、试验中，动物死亡率低。
图I.眼眶组织眼外肌病理改变，D.正常组X 100; B.中剂量组X 100，箭头所指，黏液变性、水肿、脂肪化；C.高剂量组X 100，箭头所指，肌纤维透明、变性断裂。图2.眼眶眼外肌生长抑素受体(SSTR2、5)免疫组化(箭头所指为阳性细胞)，
①正常组SSTR2 X 400 逸高剂量组SSTR2 X 400 正常组SSTR5 X 400 高剂量组SSTR5 X400。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例本发明的目的是通过模拟甲状腺功能亢进(甲亢)在行放射性碘-131 (131I)内照射的方法，建立一种简易有效的甲状腺功能减低(甲减)眼眶动物模型，病理表现相似于甲状腺相关眼病(ΤΑ0)，以供观察和探讨TAO发病机制需要。本发明通过131I腹腔注射Wistar大鼠，然后采用纯度较高的人类促甲状腺激素(hTSH)刺激Wistar大鼠，Wistar大鼠发生甲减，观察动物甲状腺、眼眶组织，判断模型的是否成功。一、材料与方法 I材料
1.I动物20只Wister大鼠(雌雄各半，平均体重220g)，由复旦大学放射医学研究所动物实验中心提供和词养。1.2主要试剂131I-碘化钠注射液(上海欣科医药有限公司)；FT3、FT4试剂盒(ROCHE诊断产品上海有限公司)；Wister大鼠促甲状腺激素(TSH)酶联试剂盒与鼠抗人生·长抑素受体多克隆抗体(简称生长抑素抗体)2和5购自美国ADL公司；SP组化试剂盒与DAB显色试剂盒购自上海长岛公司。1.3仪器 COBAS E601电化学发光法免疫测定仪(R0CHE诊断产品上海有限公司)，Multskan MS酶标仪(德国)。2 方法
2.I试验动物分组与处置将20只Wister大鼠用完全随机设计的方法分为正常组(D组)6只，实验组14只，大鼠尾静脉取血O. 5mL,测定FT3。实验组腹腔注射131I-碘化钠注射液，根据不同剂量(每只使用100μ ( 、300μ ci、500y Ci)将实验组分为三组低剂量组(Α组)4只、中剂量组(B组)和高剂量组(C组)各5只。第6周，hTSH用O. 9%生理盐水稀释到83. 2 μ g/mL，取100 μ L (含O. 0832 μ g)大鼠腹腔注射。于注射131I后第8周处死所有大鼠，心脏取血2mL，离心取上清液放置-40°C冰箱待测。用剪刀和镊子小心剥离眼眶组织,立即放入10%中性福尔马林液固定。2.2血清FT3、FT4、TSH测定用电化学发光法测定FT3、FT4, ELISA测定大鼠血清 TSH。2. 3眼眶组织病理学观察将固定的组织酒精梯度脱水，石蜡包埋切片，苏木精伊红(HE)染色，在光学显微镜下进行观察。2.4免疫组织化学法组织脱蜡至水，抗原热修复后，组织切片表面滴加生长抑素抗体2和5 (工作液浓度为I :100)，置于湿盒中，4°C冰箱内过夜。用PBS代替一抗作为阴性对照。之后经SP工作液孵育，PBS水洗，DAB显色，苏木素复染。抗体染色阳性反应产物位于细胞质内和细胞膜上，呈棕褐色颗粒状，以出现均匀完整的着色定为阳性。I. 3统计学方法
用统计分析软件应用SPSS13. O统计软件包，所有实验数据均采取均数土标准差(Y
土 S)表示。不同组比较采用方差分析，P〈O. 05为差异有统计学意义。二、结果
Wistar大鼠血清FT3、FT4和rTSH水平组间比较(表I)。表I Wistar大鼠血清FT3、FT4和rTSH水平组间比较
权利要求
1.采用放射性内照射建立甲状腺功能减低WiStar大鼠眼眶模型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤a、通过放射性131 I内照射Wistar大鼠；b、使用人类促甲状腺激素腹腔注射Wistar大鼠；c、用于观察眼眶生长抑素受体的分布。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中通过放射性131I内照射Wistar大鼠的方法是腹腔注射131I碘化钠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的131I碘化钠的腹腔注射剂量为300 μ Cl 或 500 μ Ci/ 每只。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的人类促甲状腺激素腹腔注射的时间是第6周。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤a、腹腔注射mI碘化钠注射液，注射剂量为300 μ Ci或500 μ Ci/每只；b、第6周，人类促甲状腺激素用O.9%生理盐水稀释到83. 2 μ g/mL,大鼠腹腔注射，注射剂量为100 μ L/每只。
全文摘要
本发明涉及采用放射性内照射建立甲状腺功能减低Wistar大鼠眼眶模型的方法，所述的方法包括以下步骤a、通过放射性131I内照射Wistar大鼠；b、使用人类促甲状腺激素腹腔注射Wistar大鼠；c、用于观察眼眶生长抑素受体的分布。本发明优点在于该动物模型制作简单，费用低，易重复；成功率高，85%发生甲减，甲状腺组织且有甲减的普遍特征；其中100%有甲状腺相关眼病的特征；发现眼眶生长抑素受体分布异常；试验中，动物死亡率低。
文档编号A61N5/10GK102871770SQ20121038813
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者李方都, 褚俏梅, 刘兵, 蔡德生, 药小萍 申请人:上海市普陀区利群医院