Duox2基因突变的检测探针及其检测方法

Duox2基因突变的检测探针及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种DUOX2基因突变的检测探针及其检测方法，特别涉及到与先天性甲状腺功能减低症致病基因DUOX2基因突变检测方法，属于分子生物学【技术领域】。一组检测先天性甲状腺功能减低症的DUOX2基因的PCR引物序列，为序列表SEQ?ID?No.1—SEQ?ID?No.18所示的核苷酸序列。本发明的优点是：本发明利用新一代测序对引起先天性甲状腺功能减低症的DUOX2基因进行检测，发现了24个国内外尚未报道过的新的突变位点。应用于临床基因突变检测有助于先天性甲状腺功能减低症病因分析和诊断，有助于对甲状腺功能减低症基因的突变谱有更深入的认识，加深对先天性甲状腺功能减低症发病机制的研究。
【专利说明】DU0X2基因突变的检测探针及其检测方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种DU0X2基因突变的检测探针及其检测方法，特别涉及到与先天性 甲状腺功能减低症致病基因 DU0X2基因突变检测方法，属于分子生物学【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 先天性甲状腺功能减低症（简称先天性甲低，Congenital hypothyroidism, CH) 是由于甲状腺发育不良、异位、缺失或甲状腺素合成过程中相关酶或碘的缺失引起的甲状 腺素分泌不足，从而导致智力和体格发育障碍的儿科内分泌疾病。CH在新生儿期往往是隐 匿的，临床表现不明显，难以引起家长甚至是医生的注意因而延误疾病诊断与治疗，导致对 脑发育产生不可逆的损害，CH的早期诊断及治疗可预防患者发生智力落后，使病情得到极 大改善。因此，在CH发病前对其进行早期诊断和治疗显得尤为迫切。
[0003] CH以出生时甲状腺激素水平下降、促甲状腺激素（TSH)升高为特征。CH发病与基 因和环境相关，但具体机制目前尚不明确。国外有研究报道，有2-3%的CH患者可检出基 因突变，已报道的CH相关致病基因分为两类：（1)与甲状腺发育不良有关的基因，主要包括 Pax-8、TSHR、NKX2. 1、F0XE1，NKX2. 5、TTF1、TTF2基因等；（2)与甲状腺激素合成障碍有关的 基因，主要包括0耶乂2、51^：545、了6、061^11、5^：2644以及了?0基因。
[0004] 在CH的致病基因研究中，发现基因 DU0X2的突变频率相对较高，逐渐成为研究的 重点。DU0X2基因突变诱导CH发病为常染色体隐性遗传，其编码基因位于人类15号染色 体15ql5. 3区域，包括33个外显子，cDNA长度为6. 4KB。其翻译的DU0X2蛋白由1548个 氨基酸组成，位于甲状腺细胞的顶膜，C端包含一个六次跨膜的a螺旋结构和一个NADPH和 FAD结合位点，N端包括过氧化物酶样结构和一个跨膜螺旋结构。DU0X2与甲状腺过氧化氢 (H202)的产生相关。H202作为电子受体，在甲状腺激素合成过程中，甲状腺氧化物酶（ΤΡ0) 需要H202催化氨基酸残基的碘化和碘化氨基酸残基的耦合。一旦DU0X2发生基因突变，造 成其功能异常，不能正常提供H202,使碘不能有机化，甲状腺激素合成不足，从而导致CH发 病。目前国外文献报道约有三十种DU0X2基因突变，国内报道鲜见。
[0005] 核酸测序通过对目的基因片段进行DNA序列检测，从而得到目的基因 DNA序列信 息，是现代分子生物学中应用广泛的一项重要技术，已经广泛应用于基因突变检测以及基 因分型等领域。一代测序又称为"Sanger测序"，因其成本昂贵，通量过低，手工操作时间 长，临床应用尚不广泛。


【发明内容】

[0006] 本发明的主要目的在于克服现有CH检测技术的不足，提供一组能对导致先天性 甲状腺功能减低症的多基因进行快速、全面检测的、且适用于临床患者基因突变检测及疾 病分类的多基因测序引物。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种结果准确、通量高、时的间短、成本低能同时检测 先天性甲状腺功能减低症的多个候选基因的检测方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009] -组检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的PCR引物序列，为序列表SEQ ID No. 1 - SEQ ID No. 18所示的核苷酸序列。
[0010] 本发明主要利用〇lig〇6. 0软件设计DU0X2基因 PCR扩增引物，引物设计遵循如下 几个原则：引物的长度范围在19_23bp适宜；引物应无二聚体，尤其是3'端二聚体形成的可 能性；无发夹结构；上下游引物Tm值相差不宜超过5°C;GC含量以45-55%为宜。当上下游 引物确定以后，在NCBI数据库中利用Blast对上游和下游引物进行比对分析，确保引物的 特异性及扩增效率。根据外显子相距远近程度，合并部份外显子共同设计引物，33个外显子 共设计9对引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成，上述外显子的上游引物P-F与下 游引物P-R的序列如下所示，其中P-F为上游引物，P-R为下游引物，对于不同的外显子的 具体引物设计如下：
[0011] 外显子 E1-3 上游引物 P-F:5' -GTGGGCTGCTCTCAACGCTCT-3'（SEQ ID No. 1);
[0012] 下游引物 P-R :5'-GAAGTGGTTGGGAGTCGGATGG-3'（SEQ ID No. 2);
[0013] 外显子 E4-8 上游引物 P-F:5' -CCACTTCCTCTCTACGCAGCAC-3'（SEQ ID No. 3);
[0014] 下游引物 P-R :5'-CAAATCCTACACCCAGCCACC-3'（SEQ ID No. 4);
[0015] 外显子 E9-12 上游引物 P-F:5, -GTAAACGCACATCACCAAATCTC-3'（SEQ ID No. 5);
[0016] 下游引物 P-R :5'-CTGGGAATCAAGGGCTCATAGG-3'（SEQ ID No. 6);
[0017] 外显子 E13-17 上游引物 P-F:5' -TCTCTTTTCTCACCTGGGTCCT-3'（SEQ ID No. 7);
[0018] 下游引物 P-R :5'-TCACCGAATCCTCACAACAATG-3'（SEQ ID No. 8);
[0019] 外显子 E18-19 上游引物 P-F:5' -CTTTCTGATTTGGACTTTGGG-3'（SEQ ID No. 9);
[0020] 下游引物 P-R :5, -GGCTTTTCTGGCTGGTGTTG-3，（SEQ ID No. 10);
[0021] 外显子 E20-22 上游引物 P-F:5' -GGCTGCTTTCTCTGATTGGTC-3'（SEQ ID No. 11);
[0022] 下游引物 P-R :5, -CTCACTGTCTCCCTGCTACTCC-3'（SEQ ID No. 12);
[0023] 外显子 E23-25 上游引物 P-F:5' -AGAAGTAAAGGGTTGGAGGAGG-3'（SEQ ID No. 13);
[0024] 下游引物 P-R :5' -CACTTTGTTGTTCAGGCTTGTC-3'（SEQ ID No. 14);
[0025] 外显子 E26-28 上游引物 P-F:5'-TTGCTGTGTGCCTTGTATTGTTC-3'（SEQ ID No. 15);
[0026] 下游引物 P-R :5, -TTCCCATCCTCAAACCCCTCTG-3'（SEQ ID No. 16);
[0027] 外显子 E29-33 上游引物 P-F:5'-TGGGAAGAGGGAGTAGAGAGGAG-3'（SEQ ID No. 17);
[0028] 下游引物 P-R :5'-GCCTAAGGTGGATTCTGATGGAG-3'（SEQ ID No. 18)。
[0029] 本发明引物序列的扩增产物长度平均在1. 5kb左右，通过PCR长片段扩增，可以对 目标区域进行有效地捕获。
[0030] 一种检测先天性甲状腺功能减低症的多基因测序检测方法，采用新一代测序方 法，使用PCR扩增引物，对DU0X2基因进行突变检测。
[0031] 所述的PCR扩增引物为为序列表SEQ ID No. 1 - SEQ ID No. 18所示的核苷酸序 列。
[0032] 所述方法包括以下步骤：
[0033] 1.设计多基因 PCR引物序列：为序列表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 18所示的核苷 酸序列；
[0034] 2.提取DNA样本：用常规方法提取测试者的DNA样本；
[0035] 3.扩增目标区域：利用TAKARA高保真酶，按照25μ 1体系，利用美国AB Veriti梯 度PCR仪，扩增30个循环，其中各基因外显子PCR扩增的热循环条件如下：
[0036] 95?预变性 5min ;95°C，30sec，64-69°C，30sec，72t：，60-150sec ;30 个循环；72? 延伸lOmin ;
[0037] 4. PCR产物纯化：所有产物均取2. 5 μ 1进行电泳鉴定；所有剩余PCR产物均采用 美国Omega公司过柱试剂盒进行纯化回收；
[0038] 5.文库的制备：携带测序引物片段的转座子，随机打断上述步骤的扩增产物（扩 增子），并将测序引物片段连接于片段化的扩增子（长度约为300bp)的两端进行PCR扩增， 测序引物由标签序列、P5/P7序列等组成，得到可用于测序的DNA片段；（所采用试剂盒为美 国illumina公司Nextera? XT DNA建库试剂盒，具体P5/P7、标签序列见Nextera? XT DNA Sample Preparation Guide)
[0039] 6. miseq 测序：利用 MiSeq Reagent Kit (300cycles PE)试剂盒测序，稀释文库并 使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤 并检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果；
[0040] 7.生物信息学分析
[0041] 首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3'端质量值低于20的序列、去除平 均质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上（版本号 hgl9)，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的 功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库，过滤人群中存在的多态 性位点。
[0042] 本发明通过dbSNP，HGMD, ensemb 1 e等数据库比对分析排除多态位点，利用 lOOOgenomes数据库、PubMed检索分析等方法寻找新型突变，结果共检出24种DU0X2新突 变在国内外研究中未见报道，其中错义突变（missense) 13种，剪接位点（splicing) 2种，无 义突变（nosense)3种，移码突变（frameshift)6种，具体如下所述：
[0043] 所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的新突变位点，为下述的一种 或多种：
[0044] (1)在外显子Exon3中的密码子62的CCA突变为TCA ;
[0045] (2)在外显子Exon3的密码子76位的CCG突变为CTG ;
[0046] (3)在外显子Exon3的密码子82位的CGC突变为AGC ;
[0047] (4)在外显子Exon5的密码子185的TAT变为GAT ;
[0048] (5)在外显子Exon5的cDNA序列596碱基C发生缺失；
[0049] (6)在外显子Exon5的密码子185的TCG变为CCG ;
[0050] (7)在外显子Exon7的密码子301位TGG变为TGT ;
[0051] (8)在外显子Exon8的密码子320位CTA变为CCA ;
[0052] (9)在外显子ExonlO的密码子411位的AGG变为AAG ;
[0053] (10)在外显子Exonll的密码子432的CGT突变为CAT ;
[0054] (11)在外显子Exonl4的密码子579位CTG变为CCG ;
[0055] (12)在外显子Exonl4的密码子606的TGC变为CGC ;
[0056] (13)在外显子Exonl4的密码子570的CAA变为TAA ;
[0057] (14)在外显子Exonl5的cDNA序列1868的碱基G发生缺失；
[0058] (15)在外显子Exonl6的cDNA序列2102-2104发生GAG碱基缺失；
[0059] (16)在外显子Exonl7的密码子734TGG变为TGA ;
[0060] (17)在外显子Exon21的密码子2885发生TCGA碱基插入；
[0061] (18)在外显子Exon24的密码子1084的CGA变为CAA ;
[0062] (19)在外显子Exon24的cDNA序列3339的碱基C发生缺失；
[0063] (20)在外显子Exon25的cDNA序列3475-3477的碱基CTG发生缺失；
[0064] (21)在外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG ;
[0065] (22)在外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA ;
[0066] (23)在内含子30的下游第2个碱基由T变为G ;
[0067] (24)在内含子27的下游第1个碱基由G变为T。
[0068] 先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的突变型基因，含有下述一种或多种 突变位点：
[0069] (1)在外显子Exon3中的密码子62的CCA突变为TCA ;
[0070] (2)在外显子Exon3的密码子76位的CCG突变为CTG ;
[0071] (3)在外显子Exon3的密码子82位的CGC突变为AGC ;
[0072] (4)在外显子Exon5的密码子185的TAT变为GAT ;
[0073] (5)在外显子Exon5的cDNA序列596碱基C发生缺失；
[0074] (6)在外显子Exon5的密码子188的TCG变为CCG ;
[0075] (7)在外显子Exon7的密码子301位TGG变为TGT ;
[0076] (8)在外显子Exon8的密码子320位CTA变为CCA ;
[0077] (9)在外显子ExonlO的密码子411位的AGG变为AAG ;
[0078] (10)在外显子Exonll的密码子432的CGT突变为CAT ;
[0079] (11)在外显子Exonl4的密码子579位CTG变为CCG ;
[0080] (12)在外显子Exonl4的密码子606的TGC变为CGC ;
[0081] (13)在外显子Exonl4的密码子570的CAA变为TAA ;
[0082] (14)在外显子Exonl5的cDNA序列1868的碱基G发生缺失；
[0083] (15)在外显子Exonl6的cDNA序列2102-2104发生GAG碱基缺失；
[0084] (16)在外显子Exonl7的密码子734TGG变为TGA ;
[0085] (17)在外显子Exon21的密码子2885发生TCGA碱基插入；
[0086] (18)在外显子Exon24的密码子1084的CGA变为CAA ;
[0087] (19)在外显子Exon24的cDNA序列3339的碱基C发生缺失；
[0088] (20)在外显子Exon25的cDNA序列3475-3477的碱基CTG发生缺失；
[0089] (21)在外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG ;
[0090] (22)在外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA ;
[0091] (23)在内含子30的下游第2个碱基由T变为G ;
[0092] (24)在内含子27的下游第1个碱基由G变为T。
[0093] 所述的一组检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的PCR引物序列用于制备 诊断先天性甲状腺功能减低症的检测试剂的用途。
[0094] 所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的突变型基因用于制备诊断 先天性甲状腺功能减低症的检测试剂的用途。
[0095] 所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的突变型基因用于制备治疗 先天性甲状腺功能减低症的药物的用途。
[0096] 本发明采用二代测序技术，该技术又称为新一代测序（next generation sequencing，NGS)，是测序技术革命性的进步，采用"边合成边测序"的理念，能一次对上 百万个DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和全基因组进行细致全貌的分析 成为现实。在保证高精确度的基础上，使测序成本降低。新一代测序法与传统一代测序法 相比具有下述优点：1)成本低，仅为传统测序成本的1% ;2)通量高，可以同时对多个样品 进行测序，并且进行一次可以广生大约600G喊基的数据；3)精确性商（商于98. 4% )，有 效地解决了多聚重复序列的读取问题。另一方面，高测序通量在进行测序的序列数目确定 的情况下，又反过来提高了序列的测序深度（例如，针对每个序列，可以进行多次测序），从 而确保了测序结果的可靠性。新一代测序的诞生，使基因组学和功能基因组学进入了一个 低成本、大规模、高通量的测序时代。
[0097] 新一代测序技术由于其高通量，低成本，适用于多基因致病、致病基因庞大及遗传 模式不明疾病的基因诊断。目前有关CH基因致病因素尚不明确，且疾病涉及基因较多。通 过新一代基因测序法检测研究CH相关基因突变类型和特点，由于新一代测序技术可以在 短时间内筛查数十上百个相关基因，可以让CH临床基因诊断变得更加快速，更加全面，极 大提高CH相关基因检出率，有助于我们对CH基因的突变谱有更深入的认识，了解其相关基 因在CH患者病程中的作用和影响，加深我们对CH发病机制的研究，并为后续的CH分子诊 断以及诊断试剂盒的研发打下基础。
[0098] 我们运用本发明设计的PCR引物序列和第二代测序方法，发现了 CH患者24种 DU0X2基因新突变类型，目前在国内外研究中均未见报道，分别为：外显子Exon3中的密码 子62的CCA变为TCA，使密码子62的脯氨酸（pro)变为丝氨酸（ser);外显子Exon3的密 码子76位的CCG变为CTG，使密码子76位的脯氨酸（pro)变为亮氨酸（leu);外显子Exon3 的密码子82位的CGC变为AGC，使密码子82位的精氨酸（Arg)变为丝氨酸（ser);外显子 Exon5的密码子185的TAT变为GAT，使密码子185位的酪氨酸（Tyr)变为天冬氨酸（Asp); 外显子Exon5的c. 596delC，使cDNA序列596位缺失喊基C ;外显子Exon5的密码子TCG变 为CCG，使密码子188位的丝氨酸（Ser)变为脯氨酸（Pro);外显子Exon7的密码子301位 TGG变为TGT，使密码子301位的色氨酸（Trp)变为半胱氨酸（Cys);外显子Exon8的密码 子320位CTA变为CCA，使密码子320位的亮氨酸（Leu)变为脯氨酸（Pro);外显子ExonlO 的密码子411位的AGG变为AAG，使密码子411位的精氨酸（Arg)变为赖氨酸（Lys);外显 子Exonll的密码子432位的CGT变为CAT，使密码子432位的精氨酸（Arg)变为组氨酸 (His);外显子Exonl4的密码子579位CTG变为CCG，使密码子579位的亮氨酸（Leu)变为 脯氨酸（Pro);外显子Exonl4的密码子606的TGC变为CGC，使密码子606位的半胱氨酸 (Cys)变为精氨酸（Arg);外显子Exonl4的密码子570的CAA变为TAA，使密码子570位的 谷氨酸（CAA)变为终止密码子（TAA);外显子Exonl5c. 1868delG，使cDNA序列1868缺失 碱基G ;外显子Exonl6c. 2102-2104delGAG，使cDNA序列2102-2104缺失碱基GAG ;外显子 Exonl7的密码子734TGG变为TGA，使密码子734位的色氨酸（Trp)变为终止密码子；外显 子Exon21c. 2885insTCGA，使cDNA序列2885插入碱基TCGA ;外显子Exon24的密码子CGA变 为CAA，使密码子1084位的精氨酸（Arg)变为谷氨酰胺（Gin);外显子Ex〇n24c. 3339delC， 使 cDNA 序列 3339 缺失碱基 C ;外显子 Exon25c. 3475-3477delCTG，使 cDNA 序列 3475-3477 缺失碱基CTG ;外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG，使密码子1323位的丙氨酸 (Ala)变为苏氨酸（Thr);外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA，使密码子1521 位的甘氨酸（Gly)变为终止密码子；内含子30的下游第2个碱基由T变为G(IVS30+2T>G); 内含子27的下游第1个碱基由G变为T (IVS27+1G>T)。
[0099] 本发明的优点是：本发明利用新一代测序对引起先天性甲状腺功能减低症的 DU0X2基因进行检测，发现了 24个国内外尚未报道过的新的突变位点。该方法适用于大样 本及多个外显子检测，具有耗费时间少、检测效率高、成本低、灵敏度和特异度均较高的特 点，可以快速、全面现对临床患者基因突变检测及疾病分类。应用于临床基因突变检测有助 于先天性甲状腺功能减低症病因分析和诊断，有助于对甲状腺功能减低症基因的突变谱有 更深入的认识，加深对先天性甲状腺功能减低症发病机制的研究。
[0100] 下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。应理解为：这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册见New York Cold Spring Harbor Laboratory出版社1989年版中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

【专利附图】

【附图说明】
[0101] 图1为DU0X2基因 Exon5发生c. 596delC突变测序图
[0102] 图2为DU0X2基因 Exonl5发生c. 1868delG突变测序图
[0103] 图 3 为 DU0X2 基因 Exonl6 发生 c. 2102-2104delGAG 突变测序图
[0104] 图4为DU0X2基因 Exon21发生c. 2885insTCGA突变测序图
[0105] 图5为DU0X2基因 Exon24发生c. 3339delC突变测序图
[0106] 图 6 为 DU0X2 基因 Exon25 发生 c. 3475-3477delCTG 突变测序图
[0107] 图7为DU0X2基因 Exon29的1323位密码子GCG变为ACG突变测序图
[0108] 图8为DU0X2基因 Exonl4的606位密码子TGC变为CGC突变测序图
[0109] 图9为DU0X2基因 Exon33的1521位密码子GGA变为TGA突变测序图
[0110] 图1〇为DU0X2基因内含子27的下游第1个碱基由G变为T突变测序图
[0111] 图11为DU0X2基因内含子30的下游第2个碱基由T变为G突变测序图
[0112] 图12为DU0X2基因 Exon8的320位密码子CTA变为CCA突变测序图
[0113] 图13为DU0X2基因 Exonl4的579位密码子CTG变为CCG突变测序图
[0114] 图14为DU0X2基因 Exon3的62位密码子CCA变为TCA突变测序图
[0115] 图15为DU0X2基因 Exon3的76位密码子CCG变为CTG突变测序图
[0116] 图16为DU0X2基因 Exonl4的570位密码子CAA变为TAA突变测序图
[0117] 图17为DU0X2基因 Exon3的82位密码子CGC变为AGC突变测序图
[0118] 图18为DU0X2基因 ExonlO的411位密码子AGG变为AAG突变测序图
[0119] 图19为DU0X2基因 Exonll的432位密码子CGT变为CAT突变测序图
[0120] 图20为DU0X2基因 Exon24的1084位密码子CGA变为CAA突变测序图
[0121] 图21为DU0X2基因 Exon7的301位密码子TGG变为TGT突变测序图
[0122] 图22为DU0X2基因 Exonl7的734位密码子TGG变为TGA突变测序图
[0123] 图23为DU0X2基因 Exon5的185位密码子TAT变为GAT突变测序图
[0124] 图24为DU0X2基因 Exon5的188位密码子的TCG变为CCG突变测序图

【具体实施方式】
[0125] 实施例1 :CH多基因 PCR引物设计
[0126] 利用oligo软件设计DU0X2基因 PCR扩增引物，引物设计遵循如下几个原则：引物 的长度范围在19_23bp适宜；引物应无二聚体，尤其是3'端二聚体形成的可能性；无发夹 结构；上下游引物Tm值相差不宜超过5°C ;GC含量以45-55%为宜。当上下游引物确定以 后，在NCBI数据库中利用Blast对上游和下游引物进行比对分析，确保引物的特异性及扩 增效率。根据外显子相距远近程度，合并部份外显子共同设计引物，33个外显子共设计9对 引物，由上海生工生物技术服务有限公司合成，上述外显子的上游引物P-F与下游引物P-R 的序列如下所示，其中P-F为上游引物，P-R为下游引物，对于不同的外显子的具体引物设 计如下：
[0127] 外显子 E1-3 上游引物 P-F:5' -GTGGGCTGCTCTCAACGCTCT-3'（SEQ ID No. 1);
[0128] 下游引物 P-R :5,-GAAGTGGTTGGGAGTCGGATGG-3'（SEQ ID No. 2);
[0129] 外显子 E4-8 上游引物 P-F:5' -CCACTTCCTCTCTACGCAGCAC-3'（SEQ ID No. 3);
[0130] 下游引物 P-R :5'-CAAATCCTACACCCAGCCACC-3'（SEQ ID No. 4);
[0131] 外显子 E9-12 上游引物 P-F:5' -GTAAACGCACATCACCAAATCTC-3'（SEQ ID No. 5);
[0132] 下游引物 P-R :5'-CTGGGAATCAAGGGCTCATAGG-3'（SEQ ID No. 6);
[0133] 外显子 E13-17 上游引物 P-F:5' -TCTCTTTTCTCACCTGGGTCCT-3'（SEQ ID No. 7);
[0134] 下游引物 P-R :5'-TCACCGAATCCTCACAACAATG-3'（SEQ ID No. 8);
[0135] 外显子 E18-19 上游引物 P-F:5' -CTTTCTGATTTGGACTTTGGG-3'（SEQ ID No. 9);
[0136] 下游引物 P-R :5, -GGCTTTTCTGGCTGGTGTTG-3，（SEQ ID No. 10);
[0137] 外显子 E20-22 上游引物 P-F:5' -GGCTGCTTTCTCTGATTGGTC-3'（SEQ ID No. 11);
[0138] 下游引物 P-R :5, -CTCACTGTCTCCCTGCTACTCC-3'（SEQ ID No. 12);
[0139] 外显子 E23-25 上游引物 P-F:5' -AGAAGTAAAGGGTTGGAGGAGG-3'（SEQ ID No. 13);
[0140] 下游引物 P-R :5, -CACTTTGTTGTTCAGGCTTGTC-3'（SEQ ID No. 14);
[0141] 外显子 E26-28 上游引物 P-F:5'-TTGCTGTGTGCCTTGTATTGTTC-3'（SEQ ID No. 15);
[0142] 下游引物 P-R :5' -TTCCCATCCTCAAACCCCTCTG-3'（SEQ ID No. 16);
[0143] 外显子 E29-33 上游引物 P-F:5'-TGGGAAGAGGGAGTAGAGAGGAG-3'（SEQ ID No. 17);
[0144] 下游引物 P-R :5'-GCCTAAGGTGGATTCTGATGGAG-3'（SEQ ID No. 18)。
[0145] 实施例2 :血液样本收集和基因组DNA的提取：
[0146] 按卫生部《新生儿疾病筛查技术规范》诊断标准入选病例，共选取来自广西地区无 血缘关系的CH患者192例（年龄：9天-6岁，中位年龄18天）。所有受检者或家属均签 署书面知情同意书，这项研究得到经本院伦理委员会同意，符合《世界医学协会赫尔辛基宣 言》：人体医学研究的伦理原则。
[0147] 192例血液样品按以下方法准备样品，使用试剂盒：天根生化科技（北京）有限公 司，血液基因组提取试剂盒（DP318)
[0148] 1.在500 μ 1抗凝血中加入ligsis bufferlOOO μ 1，充分颠混至清亮。以4000rpm， 离心5min。弃上清液。
[0149] 2.沉淀中加入 ligsis bufferl500 μ 1，充分混勻。以 6000rpm，离心 5min。
[0150] 3.彻底弃去上清，加入extraction buffer500 μ 1 (裂解细胞），混勻置于37°C，水 溶lh。
[0151] 4.加入8μ 1的蛋白酶K，颠混，37°C过夜（或55°C，3h)。
[0152] 5.每管加入450 μ 1饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃lOmin，以5500rpm，离心 15min〇
[0153] 6.取上清，每管加入250μ 1饱和酚和250μ 1氯仿一异戊醇，摇匀10min，以 5500rpm,离心 15min〇
[0154] 7.取上清，每管加入500μ 1氯仿一异戊醇，摇勻lOmin,以5500rpm,离心15min。
[0155] 8.取上清，每管加50μ 1的3M的NaAC，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放 入-20°C保存2h以上。
[0156] 9.以 12000rpm，离心 20min。去上清，加入 70 % 乙醇 500 μ 1，以 12000rpm，离心 5min，去上清，50 - 60°C干燥。
[0157] 10.加入50μ 1灭菌去离子水，转弹，混匀。
[0158] 实施例3 :目标区域扩增
[0159] 所有引物均送往上海生工合成，引物合成后经12, 000g离心2min使干粉沉淀，按 照说明添加高压灭菌双蒸水稀释至终浓度10uM，待其充分溶解后用于PCR实验。所有引物 退火温度均利用美国AB Veriti梯度PCR仪进行摸索，PCR扩增体系为25 μ 1。针对高GC 含量的目标片段，均在体系中添加 DMS0至终浓度为2%。对于扩增条带特异性较低的引物， 通常考虑更换退火温度或重新设计引物，保证扩增目的条带清晰、特异。
[0160] 1.引物序列：为序列表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 18的核苷酸序列。
[0161] 2. PCR 扩增体系：总反应体积为 25 μ 1 (12. 5 μ 1 的 Fermentas dreamTaq Green Buffer, 0· 5 μ 1的上下游引物，1 μ 120ng/ μ 1的DNA，10. 5 μ 1的高压双蒸水）
[0162] PCR反应条件：其中各外显子PCR扩增的热循环条件如下：
[0163] 95?预变性 5min ;95°C，30sec，64-69°C，30sec，72t：，60-150sec ;30 个循环；72? 延伸10min ;(具体Tm值与延伸时间如表1所示）
[0164] 表1 :最佳Tm值与延伸时间（X sec)
[0165]

【权利要求】
1. 一组检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的PCR引物序列，其特征在于：为 序列表SEQ ID No. 1 - SEQ ID No. 18所示的核苷酸序列。
2. -种检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的检测方法，其特征在于：采用新 一代测序方法，使用PCR扩增引物，对DU0X2基因进行突变检测。
3. 根据权利要求2所述的检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的检测方法，其 特征在于：所述的PCR扩增引物为序列表SEQ ID No. l-SEQ ID No. 18所示的核苷酸序列。
4. 根据权利要求2所述的检测先天性甲状腺功能减低症的DU0X2基因的检测方法，其 特征在于：所述方法包括以下步骤： (1) 设计多基因 PCR引物序列：为序列表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 18所示的核苷酸 序列； (2) 提取DNA样本：用常规方法提取测试者的DNA样本； (3) 扩增目标区域：利用TAKARA高保真酶，按照25μ 1体系，利用美国AB Veriti梯度 PCR仪，扩增30个循环，其中各基因外显子PCR扩增的热循环条件如下： 95?预变性 5min ;95°C，30sec，64-69°C，30sec，72t：，60-150sec ;30 个循环；72?延伸 lOmin ； (4) PCR产物纯化：所有产物均取2. 5μ 1进行电泳鉴定；所有剩余PCR产物均采用美国 Omega公司过柱试剂盒进行纯化回收； (5) 文库的制备：携带测序引物片段的转座子，随机打断上述步骤的扩增产物（扩增 子），并将测序引物片段连接于片段化的扩增子（长度约为300bp)的两端进行PCR扩增，测 序引物由标签序列、P5/P7序列等组成，得到可用于测序的DNA片段； (6) miseq测序：利用MiSeq Reagent Kit(300cycles PE)试剂盒测序，稀释文库并使 其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并 检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果； (7) 生物信息学分析 首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3'端质量值低于20的序列、去除平均 质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上（版本号 hgl9)，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的 功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库，过滤人群中存在的多态 性位点。
5. 先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的新突变位点，其特征在于：为错 义突变（missense) 13种，剪接位点（splicing) 2种，无义突变（nosense) 3种，移码突变 (frameshift)6 种。
6. 根据权利要求5所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的新突变位点， 其特征在于，所述突变位点为下述的一种或多种： (1) 在外显子Exon3中的密码子62的CCA突变为TCA ; (2) 在外显子Exon3的密码子76位的CCG突变为CTG ; (3) 在外显子Exon3的密码子82位的CGC突变为AGC ; (4) 在外显子Exon5的密码子185的TAT变为GAT ; (5) 在外显子Exon5的cDNA序列596碱基C发生缺失； (6) 在外显子Exon5的密码子185的TCG变为CCG ; (7) 在外显子Exon7的密码子301位TGG变为TGT ; (8) 在外显子Exon8的密码子320位CTA变为CCA ; (9) 在外显子ExonlO的密码子411位的AGG变为AAG ; (10) 在外显子Exonll的密码子432的CGT突变为CAT ; (11) 在外显子Exonl4的密码子579位CTG变为CCG ; (12) 在外显子Exonl4的密码子606的TGC变为CGC ; (13) 在外显子Exonl4的密码子570的CAA变为TAA ; (14) 在外显子Exonl5的cDNA序列1868的碱基G发生缺失； (15) 在外显子Exonl6的cDNA序列2102-2104发生GAG碱基缺失； (16) 在外显子Exonl7的密码子734TGG变为TGA ; (17) 在外显子Exon21的密码子2885发生TCGA碱基插入； (18) 在外显子Exon24的密码子1084的CGA变为CAA ; (19) 在外显子Exon24的cDNA序列3339的碱基C发生缺失； (20) 在外显子Exon25的cDNA序列3475-3477的碱基CTG发生缺失； (21) 在外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG ; (22) 在外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA ; (23) 在内含子30的下游第2个碱基由T变为G ; (24) 在内含子27的下游第1个碱基由G变为T。
7.先天性甲状腺功能减低症相关的DU0X2基因的突变型基因，其特征在于，含有下述 一种或多种突变位点： (1) 在外显子Exon3中的密码子62的CCA突变为TCA ; (2) 在外显子Exon3的密码子76位的CCG突变为CTG ; (3) 在外显子Exon3的密码子82位的CGC突变为AGC ; (4) 在外显子Exon5的密码子185的TAT变为GAT ; (5) 在外显子Exon5的cDNA序列596碱基C发生缺失； (6) 在外显子Exon5的密码子185的TCG变为CCG ; (7) 在外显子Exon7的密码子301位TGG变为TGT ; (8) 在外显子Exon8的密码子320位CTA变为CCA ; (9) 在外显子ExonlO的密码子411位的AGG变为AAG ; (10) 在外显子Exonll的密码子432的CGT突变为CAT ; (11) 在外显子Exonl4的密码子579位CTG变为CCG ; (12) 在外显子Exonl4的密码子606的TGC变为CGC ; (13) 在外显子Exonl4的密码子570的CAA变为TAA ; (14) 在外显子Exonl5的cDNA序列1868的碱基G发生缺失； (15) 在外显子Exonl6的cDNA序列2102-2104发生GAG碱基缺失； (16) 在外显子Exonl7的密码子734TGG变为TGA ; (17) 在外显子Exon21的密码子2885发生TCGA碱基插入； (18) 在外显子Exon24的密码子1084的CGA变为CAA ; (19) 在外显子Exon24的cDNA序列3339的碱基C发生缺失； (20) 在外显子Exon25的cDNA序列3475-3477的碱基CTG发生缺失； (21) 在外显子Exon29密码子1323位的GCG变为ACG ; (22) 在外显子Exon33的密码子1521位的GGA变为TGA ; (23) 在内含子30的下游第2个碱基由T变为G ; (24) 在内含子27的下游第1个碱基由G变为T。
8. 权利要求1所述的一组检测先天性甲状腺功能减低症的DUOX2基因的PCR引物序列 用于制备诊断先天性甲状腺功能减低症的检测试剂的用途。
9. 权利要求7所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DUOX2基因的突变型基因用于制 备诊断先天性甲状腺功能减低症的检测试剂的用途。
10. 权利要求7所述的先天性甲状腺功能减低症相关的DUOX2基因的突变型基因用于 制备治疗先天性甲状腺功能减低症的药物的用途。
【文档编号】C12N15/11GK104120187SQ201410383389
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】陈少科, 顾学范, 陈荣誉, 付春云, 罗静思, 范歆, 李川 申请人:广西壮族自治区妇幼保健院