一种多功能3D重组皮肤模型的低温保存方法与流程

本发明涉及一种多功能3d重组皮肤模型的低温保存方法，属于生物医学领域。

背景技术：

随着体外器官培养基体外替代技术的发展，基于3d体外细胞培养构建的3d重组皮肤模型在刺激性试验安全性及有效性评价方面表现出特有的趋势。体外构建的3d表皮模型类似于人体皮肤结构，可以用于化妆品检测的体外替代试验；体外构建的3d全层皮肤是具有活细胞的组织工程皮肤，具有表皮层和真皮层，可以参与创面与伤口的修复，可用于由多种原因引起的皮肤缺损的修复，加快皮肤创伤的愈合，并形成功能性的皮肤，以此来减轻患者疼痛，提高患者的生活质量。

但是，由于体外3d重组皮肤模型的特点，要求模型具有稳定性，并且在长距离运输过程中能够很好的保持其原有的特性，以期能够测试并检验出化学物质或其他因素对其影响，从而得到准确的结果。而全层皮肤用于临床上也需要克服异地运输的困难，以保证运输后的皮肤具有一定的活性，从而确保临床应用的效果。目前关于适用于低温保存运输皮肤模型及组织工程皮肤的固体培养基已有相关报道(如中国专利201410418456.x，201510697694.3，201510697887.9)，但目前固体保存仍有较大局限性，其保存时间仍为限制性因素。

细胞松弛素b具有多种生物学功能，尤其是对于微丝结构的影响，它作为冷冻保护剂，可以增加细胞骨架弹性，这对于我们进行低温保存而言至关重要，目前已有中国专利201410418456.x将细胞松弛素b添加于保存液中，但迄今为止，已报道的文献中关于细胞松弛素b的利用均发生在液体环境中，并且剂量添加和处理时间长短的差异对细胞或组织都会产生巨大影响。由于固体保存较液体保存溶液流动性差，许多分子运动受限，致使物质交换能力降低，这在很大程度上限制了固体保存时限的延长。

技术实现要素：

本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种多功能3d重组皮肤模型的低温保存方法，本发明首次将细胞松弛素b应用于皮肤模型的固体保存中，该处理方法可以维持模型在运输过程中的细胞活性，减少细胞缺氧性损伤，以保证3d重皮肤组模型测试的准确性和细胞的活力，并极大程度延长保存时间。

一种多功能3d重组皮肤模型的低温保存方法，包括如下步骤：

1)利用细胞培养技术培养3d重组皮肤模型；

2)在步骤1)培养的3d重组皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素b，添加的细胞松弛素b在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理1-24h；

3)将经过步骤2)处理的3d重组皮肤模型置于改良的液体保存液中，4℃预冷0.5h-12h；

4)配制改良的固体培养基，将获得的固体培养基加入经过步骤3)处理过的3d重组皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。

进一步的，上述步骤2)中所述的细胞培养液是以基础培养基为主体添加生长因子的培养液；

所述基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

所述生长因子包括氢化可的松、腺嘌呤、itt、l-谷氨酰胺、eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)、人表皮生长因子(hegf)、牛垂体提取物(bpe)、硒、胎牛血清。

进一步的，上述氢化可的松在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml、上述腺嘌呤在基础培养基中的终浓度为10～30mm、上述itt在基础培养基中的终浓度为5.0～10.0ug/ml，上述l-谷氨酰胺的浓度为30～60mm，上述eop在基础培养基中的终浓度为1～10mm，上述人表皮生长因子(hegf)在基础培养基中的终浓度为0.1～1ng/ml，上述硒在基础培养基中的终浓度为10^-3～0.1nm，上述牛垂体提取物(bpe)在基础培养基中的终浓度为0.1～2ug/ml，胎牛血清在基础培养基中的体积分数为2～10％。

进一步的，上述步骤3)中所述的改良的液体保存液的制备方法包括如下步骤：

s1配制细胞培养液；

s2在步骤s1获得的细胞培养液中添加细胞松弛素b、海藻糖、蔗糖、甘氨酸、丙氨酸、腺苷、维生素c、维生素e、透明质酸、硫酸软骨素、去铁胺、1,6-二磷酸果糖，即可获得改良的液体保存液。

进一步的，上述步骤s2中所述细胞松弛素b在液体保存液中的终浓度1-2ug/ml，所述海藻糖在液体保存液中的终浓度为1～20mm，所述蔗糖在液体保存液中的终浓度为50～100mm，所述甘氨酸在液体保存液中的终浓度为1～20mm，所述丙氨酸在液体保存液中的终浓度为1～10mm，所述腺苷在液体保存液中的终浓度为1～10mm，所述维生素e在液体保存液中的终浓度为10mm～30mm，所述维生素c在液体保存液中的终浓度为10mm～40mm，所述去铁胺在液体保存液中的终浓度为1mm～10mm，所述1,6-二磷酸果糖在液体保存液中的终浓度为1～15mm、所述透明质酸在液体保存液中的体积分数为0.01～1％、所述硫酸软骨素在液体保存液中的终浓度为0.5～2g/l。

进一步的，上述步骤4)中所述的改良的固体培养基由琼脂糖溶液与改良的液体保存液按照体积比1:1混合均匀后凝固而成。

进一步的，上述琼脂糖溶液的浓度为0.25％～5％，所述琼脂糖为低熔点琼脂糖，熔点为60～70℃，凝固温度为28℃～32℃。

有益效果：

(1)使用本发明的方法可以最大程度减轻重组模型在运输过程中遭遇的如低温、高渗等不利因素对细胞骨架所造成的损伤，维持重组皮肤的细胞活性，保证模型测试结果的准确性以及临床应用的良好效果。

(2)该方法将保存时间延长至120h以上，极大额延长保存时间以确保长距离的低温运输，更利于组织工程应用产业化的实现。

(2)细胞松弛素b由适宜低浓度到高浓度可以减缓温度变化对细胞骨架形变所产生的影响；三步法中第二步处理，提前在4℃对模型进行液体保存，由于液体保存较固体保存流动性强，能提高保存液中各种保护成分与皮肤模型进行物质交换的能力，最大程度维持温度降低时的皮肤内外渗透压，此后再进行后续固体保存，经过本方法的处理可以极大程度减轻固体保存过程对皮肤模型的损伤，延长保存时限。

(3)该方法可以适用于2种以上3d重组皮肤模型的低温运输，可用于多种3d重组皮肤模型(3d表皮模型、3d全层皮肤模型、3d真皮模型)的保存。

(4)在使用模型前，将模型放入复苏培养基中培养21±3h后，即可用于检测，使用方便快捷，且复苏后原皮肤模型的功能不会有不良影响。

附图说明

图1固体保存和液体保存对皮肤模型的不同应用效果。

图2不同浓度细胞松弛素b对皮肤真皮成纤维细胞和表皮细胞活性的影响。

图33d表皮模型和3d全层皮肤模型低温保存复苏结果对比。

图4不同条件下，表皮模型h&e染色结果。

图5正常条件下全层皮肤模型移植结果。

图6全层皮肤模型经本发明的方法保存120h复苏后小鼠移植结果。

图7使用细胞松弛素b直接进行固体方法保存120h复苏后小鼠移植结果。

具体实施方式

为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。

实施例1固体保存和液体保存对皮肤模型的不同应用

一、实验步骤

1、配制液体保存液

(1)配制基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

(2)在基础培养液中按浓度加入添加的因子，因子浓度如下：氢化可的松的浓度为1ug/ml、腺嘌呤20nm、itt的浓度为10.0ug/ml，l-谷氨酰胺的浓度为40mm，eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)的浓度为10nm，人表皮生长因子(hegf)的浓度为0.5ng/ml，牛垂体提取物(bpe)的浓度为1ug/ml，硒的浓度为10^-2nm，胎牛血清的体积分数为5％。配制完毕后使用0.22um滤膜过滤除菌，获得除菌的培养液。

(3)在步骤(2)获得的除菌培养液中按浓度添加保护剂，添加物先后顺序，待其充分溶解后，过滤除菌。保护剂浓度如下：细胞松弛素浓度2ug/ml，海藻糖的浓度为10mm、蔗糖的浓度为100mm、甘氨酸的浓度为10mm、丙氨酸的浓度为5mm、腺苷的浓度为5mm、维生素e的浓度为20mm、维生素c的浓度为30mm、去铁胺(dfo)的浓度为10mm、1,6-二磷酸果糖(fdp)的浓度为10mm、透明质酸的体积分数为0.01％、硫酸软骨素的浓度为1g/l，获得液体保护液。

(4)将3d全层皮肤模型放入步骤(3)获得的液体保存液中，置于4℃冰箱中保存。如图1中的a(全层皮肤液体保存)。

2、配制固体保存液

按照如上述1中(1)-(4)获得液体保存液。

(5)在步骤(4)中获得的液体保存培养液中按照体积比1:1加入2.5％的琼脂糖溶液，混合均匀后室温冷却至培养基凝固，即可对皮肤模型进行固体保存。如图1中的b(表皮模型固体保存)。

二、实验结果

图1中a是经过液体保存后的效果图，图1中的b是经过固体保存后的效果图。如图1中的b所示，相比液体保存，固体保存明显更利于体外表皮模型的运输，避免表皮模型表面有任何其他试剂的接触，最大限度保证检测结果的准确性。皮肤模型用于试剂检测的话，是不能接触任何液体的，否则会造成不良影响，比如检测结果不准确，如果使用图1中的a的保存效果则液体会接触表面皮肤(皮肤模型是沿培养皿表面生长)，而使用固体保存则可以有效避免该问题。

如图1中的b所示，由于体外表皮模型适用于检测某些化学物质对皮肤产生的各种影响，如化妆品检测中某种检测物质是否对皮肤产生刺激性和腐蚀性，并对其程度进行科学的评价以期得到准确的结果，因此要求模型在长距离运输过程中能够保持其原有的特性并具有良好的稳定性。液体保存对于该模型的应用具有很大的局限性，导致检测结果出现较大误差，因此本实验室在液体保存的基础上发明该固体保存培养基，并采用三步法进行保存。

实施例2细胞松弛素b的浓度对皮肤细胞活性的影响

一、实验步骤

步骤1实验时将浓度20mg/ml的细胞松弛素b稀释成以下试验浓度：1mg/ml，10ug/ml，5ug/ml，1ug/ml，0.1ug/ml。

步骤2取对数生长期状态良好的真皮成纤维细胞和表皮细胞经消化、离心、计数后用真皮培养基和表皮培养基分别进行重悬，以真皮细胞每孔60万，表皮细胞每孔80万接种于96孔细胞培养板中，每孔体积100ul。

步骤3待细胞贴壁后添加步骤1中不同浓度细胞松弛素b，体积为100ul，每个浓度设三个重复，真皮和表皮对照组各自添加体积为100ul的真皮培养基和表皮培养基，置于37℃，5％co2培养箱中进行培养。

步骤4培养24h后使用mtt法检测细胞活力。

二、实验结果

如图2所示，由于细胞松弛素b在不同浓度和不同细胞中存在不同程度的副作用，经验证本发明中所使用细胞在培养处理24h时，细胞松弛素b在0.1-5ug/ml浓度时细胞仍能保持较好活性，且真皮成纤维细胞较表皮细胞活性更好。

实施例33d表皮模型低温保存

一、实验操作

1、设置实验组

利用细胞培养技术培养3d表皮模型模型，在3d表皮模型培养结束时，将培养完成后的表皮模型分为对照组，实验组1和实验组2，对照组处理方法即培养完成后不进行保存处理直接进行mtt检测，实验组1和2分别为直接进行传统固体保存和采用本发明的三步法固体保存，之后再对表皮模型进行复苏，并对其复苏前后的细胞活率进行比较。

2、处理实验组1

(1)配制基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

(2)在基础培养液中按浓度加入添加的因子，因子浓度如下：氢化可的松的浓度为1ug/ml、腺嘌呤20nm、itt的浓度为10.0ug/ml，l-谷氨酰胺的浓度为40mm，eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)的浓度为10nm，人表皮生长因子(hegf)的浓度为0.5ng/ml，牛垂体提取物(bpe)的浓度为1ug/ml，硒的浓度为10^-2nm，胎牛血清的体积分数为5％。配制完毕后使用0.22um滤膜过滤除菌，获得除菌的培养液，保存备用。

(3)在步骤(2)获得的除菌培养液中按浓度添加保护剂，添加物先后顺序，待其充分溶解后，过滤除菌。保护剂浓度如下：细胞松弛素浓度2ug/ml、，海藻糖的浓度为10mm、蔗糖的浓度为100mm、甘氨酸的浓度为10mm、丙氨酸的浓度为5mm、腺苷的浓度为5mm、维生素e的浓度为20mm、维生素c的浓度为30mm、去铁胺(dfo)的浓度为10mm、1,6-二磷酸果糖(fdp)的浓度为10mm、透明质酸的体积分数为0.01％、硫酸软骨素的浓度为1g/l，获得液体保护液。

(4)在步骤(3)中获得的液体保存培养液中按照体积比1:1的比例加入2.5％琼脂糖溶液，混合均匀后室温冷却至培养基凝固，对3d表皮模型进行固体保存，即为实验组1。

3、处理实验组2

(1)配制基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

(2)在基础培养液中按浓度加入添加的因子，因子浓度如下：氢化可的松的浓度为1ug/ml、腺嘌呤20nm、itt的浓度为10.0ug/ml，l-谷氨酰胺的浓度为40mm，eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)的浓度为10nm，人表皮生长因子(hegf)的浓度为0.5ng/ml，牛垂体提取物(bpe)的浓度为1ug/ml，硒的浓度为10^-2nm，胎牛血清的体积分数为5％。配制完毕后使用0.22um滤膜过滤除菌，获得除菌的培养液。

(3)在步骤(2)获得的除菌培养液中按浓度添加保护剂，添加物先后顺序，待其充分溶解后，过滤除菌。保护剂浓度如下：细胞松弛素浓度2ug/ml、，海藻糖的浓度为10mm、蔗糖的浓度为100mm、甘氨酸的浓度为10mm、丙氨酸的浓度为5mm、腺苷的浓度为5mm、维生素e的浓度为20mm、维生素c的浓度为30mm、去铁胺(dfo)的浓度为10mm、1,6-二磷酸果糖(fdp)的浓度为10mm、透明质酸的体积分数为0.01％、硫酸软骨素的浓度为1g/l，获得液体保护液。

(4)将实验组2的3d表皮模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素b，添加的细胞松弛素b在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理2h。

(5)将经过步骤(4)处理的3d表皮模型置于步骤(4)获得的液体保护液中，4℃预冷1h。

(6)配制改良的固体培养基(按照上述步骤(1)-(3)获得液体保护液，在液体保护液中按照体积比1:1的比例加入2.5％琼脂糖溶液，即可获得改良的固体培养基)，将获得的固体培养基加入经过步骤(5)处理过的3d表皮模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。

4、复苏检测

分别将实验组1和实验组2的3d表皮模型在冷藏(4℃)保存120h以后分别使用mtt法检测表皮模型中的表皮细胞活力并观察组织学结构。对照组培养完成后不进行保存处理直接进行mtt检测。

二、实验结果

图3中的a为3d表皮模型低温保存复苏结果，图中组1为实验组1，组2为使用细胞松弛素b进行三步法预处理的模型细胞活率的实验组2，结果表明，采用三步法预处理的表皮模型在保存和复苏步骤处理后都比直接进行固体保存效果好，尤其是在复苏后细胞或率比直接法提高至少20％。

图4中a为正常条件下表皮模型h&e染色结果，图4中b为实验组2使用本发明三步法预处理保存120h后表皮模型h&e染色结果，图4中c为实验组1的皮肤模型复苏后h&e染色结果，结果显示，三步法预处理保存120h后，模型的表皮结构完整，明显可见较厚角质层，而直接保存法则表皮结构松散，不完整。

实施例43d全层皮肤模型低温保存

一、实验操作

1、设置实验组

利用细胞培养技术培养3d全层皮肤模型，在3d全层皮肤模型培养结束时，将培养完成后的3d全层皮肤模型分为对照组，实验组1和实验组2，对照组处理方法即培养完成后不进行保存处理直接进行mtt检测，实验组1和2分别为直接进行传统固体保存和采用本发明的三步法固体保存，之后再对表皮模型进行复苏，并对其复苏前后的细胞活率进行比较。

2、处理实验组1

(1)配制基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

(2)在基础培养液中按浓度加入添加的因子，因子浓度如下：氢化可的松的浓度为1ug/ml、腺嘌呤20nm、itt的浓度为10.0ug/ml，l-谷氨酰胺的浓度为40mm，eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)的浓度为10nm，人表皮生长因子(hegf)的浓度为0.5ng/ml，牛垂体提取物(bpe)的浓度为1ug/ml，硒的浓度为10^-2nm，胎牛血清的体积分数为5％。配制完毕后使用0.22um滤膜过滤除菌，获得除菌的培养液，保存备用。

(3)在步骤(2)获得的除菌培养液中按浓度添加保护剂，添加物先后顺序，待其充分溶解后，过滤除菌。保护剂浓度如下：细胞松弛素浓度2ug/ml，海藻糖的浓度为10mm、蔗糖的浓度为100mm、甘氨酸的浓度为10mm、丙氨酸的浓度为5mm、腺苷的浓度为5mm、维生素e的浓度为20mm、维生素c的浓度为30mm、去铁胺(dfo)的浓度为10mm、1,6-二磷酸果糖(fdp)的浓度为10mm、透明质酸的体积分数为0.01％、硫酸软骨素的浓度为1g/l，获得液体保护液。

(4)在步骤(3)中获得的液体保存培养液中按照体积比1:1的比例加入2.5％琼脂糖溶液，混合均匀后室温冷却至培养基凝固，对实验组1的3d全层皮肤模型进行固体保存。即为实验组1。

3、处理实验组2

(1)配制基础培养基为dmem、f12或dmem和f12复配的混合液，所述dmem和f12复配的混合液中dmem和f12体积比为4:1-12。

(2)在基础培养液中按浓度加入添加的因子，因子浓度如下：氢化可的松的浓度为1ug/ml、腺嘌呤20nm、itt的浓度为10.0ug/ml，l-谷氨酰胺的浓度为40mm，eop(乙醇胺和催化磷脂酰乙醇胺)的浓度为10nm，人表皮生长因子(hegf)的浓度为0.5ng/ml，牛垂体提取物(bpe)的浓度为1ug/ml，硒的浓度为10^-2nm，胎牛血清的体积分数为5％。配制完毕后使用0.22um滤膜过滤除菌，获得除菌的培养液。

(3)在步骤(2)获得的除菌培养液中按浓度添加保护剂，添加物先后顺序，待其充分溶解后，过滤除菌。保护剂浓度如下：细胞松弛素浓度2ug/ml，海藻糖的浓度为10mm、蔗糖的浓度为100mm、甘氨酸的浓度为10mm、丙氨酸的浓度为5mm、腺苷的浓度为5mm、维生素e的浓度为20mm、维生素c的浓度为30mm、去铁胺(dfo)的浓度为10mm、1,6-二磷酸果糖(fdp)的浓度为10mm、透明质酸的体积分数为0.01％、硫酸软骨素的浓度为1g/l，获得液体保护液。

(4)将实验组2的3d全层皮肤模型处于培养末期时更换细胞培养液，换液后在培养液中添加细胞松弛素b，添加的细胞松弛素b在培养液中的终浓度为0.1-5ug/ml，37℃处理2h。

(5)将经过步骤(4)处理的3d全层皮肤模型置于步骤(4)获得的液体保护液中，4℃预冷1h。

(6)配制改良的固体培养基(按照上述步骤(1)-(3)获得液体保护液，在液体保护液中按照体积比1:1的比例加入2.5％琼脂糖溶液，即可获得改良的固体培养基)，将获得的固体培养基加入经过步骤(5)处理过的3d全层皮肤模型外部，凝固后放入无菌包装袋中封口。

4、复苏检测

分别将实验组1和实验组2的3d全层皮肤模型在冷藏(4℃)保存120h以后分别使用mtt法检测表皮模型中的表皮细胞活力并观察组织学结构。对照组培养完成后不进行保存处理直接进行mtt检测。

二、实验结果

图3中的b为3d全层皮肤模型低温保存复苏结果，图中组1为添加第二步中同样浓度细胞松弛素b直接进行固体保存的模型细胞活率，组2为使用细胞松弛素b进行三步法预处理的模型细胞活率，对比之后发现，在全层皮肤模型的保存和复苏后，三步法预处理的模型复苏后细胞活率为94.38％，直接法为75.34％，表明细胞松弛素b三步法预处理能明显提高模型的保存活率。

实施例53d全层皮肤模型低温保存后复苏移植

按照实施例3中的3中方法保存3d全层皮肤模型，低温(4℃)保存的3d全层皮肤模型在冷藏120h以后，复苏24±3h后，进行裸鼠移植实验。实验使用正常条件下3d全层皮肤作为对照。在移植3d全层皮肤2个月后，取再生部位的皮肤进行石蜡切片h&e染色，观察形成的皮肤的组织学结构。

如图5-7所示，图5为对照组，即正常条件下全层皮肤模型移植结果，图5中的a为移植后2个月形成的再生皮肤表观图，图5中的b为移植2月后形成的皮肤的h&e染色结果，正常移植2月后小鼠疤痕恢复良好，he染色显示皮肤具有真皮层和表皮层和皮下组织，有分化的角质层，结构紧密完整。图6为使用细胞松弛素b进行三步法预处理保存120h复苏后小鼠移植结果，图6中的a为移植后2个月形成的再生皮肤表观图，图6中的b为移植2月后形成的皮肤的h&e染色结果，与对照相比，小鼠总体恢复较好，皮肤结构较完整。图7为添加细胞松弛素b直接进行固体方法保存120h复苏后小鼠移植结果，图7中的a为移植后2个月形成的再生皮肤表观图，图7中的b为移植2月后形成的皮肤的h&e染色结果，疤痕愈合结果显示直接固体保存法较对照和三步法预处理保存法进行移植后的创面恢复较差，he染色显示皮肤结构完整但是表皮层中的角质层较薄且出现分离，真皮层及皮下结构散乱。